[发明专利]一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用

说明书

 

技术领域

    本发明涉及检测肝癌标志物CK-19用的兔多克隆抗体，具体地说，涉及一种抗肝脏肿瘤标志物CK-19的多肽抗体的制备及其应用。

背景技术

细胞角蛋白（Keratin, type I cytoskeletal）是细胞体的中间丝，根据其分子量和等电点不同可分为20种不同类型。在胚胎肝细胞中表达CK8、CK18、CK-19，随着肝脏的分化，CK-19在正常肝细胞不表达，只在胆管中表达。CK-19对胆管上皮和胆管细胞癌（ICC）具有特异性染色，阳性率达77%~100%，是目前诊断ICC最好的免疫组化标志物之一。当肝细胞发生癌变时，有些癌细胞又重新表达CK-19，部分为分子结构不完整的CK-19，且表达程度与细胞的分化程度呈负相关。当细胞出现坏死时，CK-19以溶解片段的形式释放于血清中，能在血液中检出，检测指标为细胞角质素偏低抗原。Nagai等报道，在70例肝癌患者中，33例外周血CK-19升高，在同时检测CK-19和AFP的患者中，有12.3%的患者CK-19升高而AFP正常。两者联合检测对诊断有一定的互补性。Ding SJ等发现CK-19在高转移力细胞株中高表达，且随着转移力的升高表达量亦呈上升趋势。李雁等进一步探索了CK-19与肝癌患者临床病理指标的关系，表明血清CK-19升高与HCC分化程度低，血管侵袭力强，临床病期晚有一定的关系。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19的多克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

为便于与载体蛋白偶联，在上述多肽序列的C端连接一个半胱氨酸。

本发明选择了CK-19蛋白N端14肽作为候选多肽，并用人工方法进行多肽合成制备免疫原。

上述多肽序列免疫动物可获得多克隆抗体，所述多克隆抗体能用于制备肝癌诊断药物。

本发明用上述免疫原免疫新西兰兔，获得可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19的多克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明对CK-19蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别CK-19蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

附图说明

图1是抗CK-19多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后经SDS-PAGE电泳 (12%)检测结果。M: 蛋白Marker：Lane 1：上样峰；Lane 2：流穿峰；Lane 3：平衡峰；Lane 4：洗脱峰。

图2是本发明中的抗CK-19多克隆抗体的western-blot鉴定结果。上样为HepG2细胞（人肝癌细胞系）裂解液。

具体实施方式

本发明设计和人工合成CK-19多肽抗原，与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白（KLH）偶联，经脱盐纯化后免疫新西兰兔，通过多次免疫及ELISA效价检测后，采集兔血清并经protein G凝胶纯化柱纯化。该多克隆抗体经过ELISA、western blot等鉴定，可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：CK-19多肽的设计及合成

1. CK-19氨基酸序列

根据GenBank获得人CK-19氨基酸序列 (P08727)：如SEQ NO.2所示。

结果：人CK-19蛋白含有400氨基酸。

2. http://www.uniprot.org/uniprot在线分析CK-19结构域（表1）：

表1