[发明专利]含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物。 

背景技术

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor，简称GM-CSF)属于细胞因子类重组蛋白，自从1985年Wong等人克隆得到了GM-CSF的cDNA序列以来(Wong GG et al.，Science，1985，228：810-815)，相继有不同种类的GM-CSF类似物得到克隆(US5,391,485、US 5,942,253和US 6,120,807)。而基因工程技术的发展，使大规模表达GM-CSF成为可能。临床上，GM-CSF主要作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒细胞、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能(Nemunaitis J.et al.，Blood，1988，72：834-836；Silver GM et al.，Surgery，1989；106：452-455)。 

重组蛋白长效制剂的开发主要使用的技术包括脂质体包埋技术和聚乙二醇(PEG)化技术，脂质体可以有效的减少蛋白被免疫系统或者蛋白酶的识别和吞噬，延长其体内的作用时间，但是由于包埋技术的限制，该项技术一直没有得到大规模的开发利用。而重组蛋白的聚乙二醇(PEG)化在过去的几年里已经得到了长足的发展，有多个PEG化产品已经上市并取得了惊人的业绩，如Amgen公司开发的PEG化的G-CSF，商品名Neulasta，Roche开发PEG化的重组人干扰素α-2a，商品名Pegasys。 

作为重组蛋白药品，GM-CSF的血清半衰期很短，静脉注射GM-CSF的清除半衰期为1～2小时，皮下注射则为2～3小时，在24小时内有45％药 物经尿液排出。为了维持足够的血药浓度，病人就不得不频繁的接受药品注射，这给病人带来了极大的不变和痛苦。因而，有许多科学家都在致力于长效GM-CSF制剂的开发，例如加拿大的Cangene公司就在GM-CSF的N端连接了不同分子量的PEG分子，这些PEG化的GM-CSF与未PEG化的GM-CSF相比，体外活性没有明显的变化，但是半衰期却延长了27～40倍(Lee DL，et al.，Journal of interferon & cytokine research，2008，28(2)：101-112)。但是一般来说，传统的PEG化产品多数都存在产品不均一和生物活性下降等明显的缺点，这是由PEG分子的特性和重组蛋白大分子量所导致的多个连接位点的特点所决定的。 

因此开发优质长效的GM-CSF制剂就很有必要，这不仅要求该制剂有很长的半衰期，而且重组蛋白原有活性也需要得到较好的保持，另外，制剂还要保持很好的均一性。 

由于大肠杆菌表达系统具有低成本产量高的特点，其是许多非糖基化重组蛋白的首选表达宿主。天然GM-CSF虽然有糖基化，但是，据报道，其非糖基化形式比天然的GM-CSF活性还要高4～6倍(Kaushansky K.，et al.，Biochemistry，1987，26：4861-4867)，因而，许多科学家都致力于在大肠杆菌中表达GM-CSF，如有将GM-CSF在大肠杆菌中表达并分泌到周质腔里面的方法(CN98106057)，这种方法虽然避免了包涵体变性复性的步骤，但是在将重组蛋白从周质腔释放出来时却很容易破坏细胞膜，而细胞膜破坏后，大肠杆菌里面的很多宿主蛋白尤其是核酸将给后续的纯化带来很大的困难，相对而言，包涵体的表达形式更加适合重组蛋白的下游纯化。 

天然的GM-CSF基因N端GC含量很高并非常容易形成二级结构，同时基因内部还有很多大肠杆菌的稀有密码子，这些因素都是GM-CSF无法在大肠杆菌中得到高表达的因素(张智清等，病毒学报，1993，9：136-142)。虽然基因改造的文章和专利时见报道，例如专利CN95101619，但它仅仅对N端基因和终止密码子进行了改造，要得到产品的高表达，这种优化是远远不够的。 

因此，仍然需要对GM-CSF基因进行多方面改造，并在发酵罐上对发酵条件进行优化，使GM-CSF在发酵罐中得到适合大规模生产的高表达，同时 还存在对开发长效重组GM-CSF的技术的需求。 

发明概述