[发明专利]一种检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及检测多种高致病性病原细菌的方法和试剂盒。

背景技术

引起突发传染病的病原体，在平时可造成烈性传染病爆发流行，在战时可作为生物武器。这些病原微生物主要分为六大类：病毒类、细菌类、立克次体类、衣原体类、支原体类和真菌类，主要的有40余种。炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)，鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，羊布鲁菌(Brucella mallei)，牛布鲁菌(Brucella abortus)，猪链球菌2(Streptococcus suis II)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，土拉弗菌(Francisella tularensis)，鼻疽假单胞菌(Burkholderia mallei)，类鼻疽假单胞菌(Burkholderia pseudomallei)，贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)等都是高致病性病原细菌。

目前，可能引起国内突发传染病(生物恐怖或生物突发事件)的细菌类病原体主要有：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌、肉毒梭菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、布鲁氏菌、猪链球菌、贝纳柯克斯体(属立克次体类)、嗜肺军团菌等。这些病菌对人的危害巨大，其中鼠疫耶氏菌、霍乱弧菌属于甲类传染病致病菌，布鲁氏菌、炭疽芽胞杆菌属于乙类传染病致病菌，土拉弗菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、猪链球菌、嗜肺军团菌也具有很强的致病性，严重时可以危及生命。

传统的检测方法为培养鉴定法，通过病菌培养后的外观和一些理化指标进行鉴定，耗时要二至五天时间，同时相对容易出现误判。后来兴起的分子鉴定法，利用链式聚合酶反应(PCR)对病菌的基因的脱氧核糖核酸(DNA)进行检测与鉴定。

分子鉴定法主要分为两类。

第一，对病菌的16S rRNA或23S rRNA基因基因检测和鉴定，一般是进行序列测定，即PCR-测序法，其中16S rRNA的检测应用最广泛；这种方法一般需要先对病菌进行分离培养，然后再进行分子鉴定，可靠性最高，鉴定最准确，不过耗时仍然很长。

第二，对病菌的特异性基因的DNA进行检测和鉴定，这种方法无需培养，大大缩短了检测时间，一般只需要几个小时就可以完成；但这种方法有一个缺点，即每次检测只能判断其是或不是某种病菌，然后进行另一次反应判断其是或不是另一种病菌，因此这个方法都有相应检测范围，即只能检出其检测范围内的病菌，假如要检测十种病菌就要进行十次反应，虽然这些反应可以依次，也可以平行进行，但总体来讲比较繁琐。

有人采用“PCR-固态芯片”的办法来进行分子检测，即先对病菌DNA进行PCR扩增，然后将能识别不同病菌序列的DNA探针按照一定的顺序和位置偶联在玻璃片、膜条等固态介质上构成DNA芯片，将PCR产物置于芯片上进行杂交和信号检测，提高了检测的通量，一次反应就能检测出多种病菌。不过，与其他固态芯片检测一样，受固态芯片自身缺陷所致，这种方法需要多次洗涤，过程仍显繁琐，同时灵敏度一般也不高，更重要的是重复性较差，检测质量不稳定。

综上所述，本领域尚缺乏令人满意的、能够同时检测多种高致病性病原菌的技术。因此，本领域迫切需要开发高灵敏度的、简便快捷的、高通量地检测多种高致病性病原菌的方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高灵敏的、简便快捷的、高通量地检测多种高致病性病原菌的方法和试剂盒。

本发明的第一方面提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤：

(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少5种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集，其中所述的高致病性病原菌选自：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。

在另一优选例中，所述的反应体系中含有特异性扩增以下6、7、8、9或10种高致病性病原菌的扩增产物的特异性引物集：炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶氏菌、肉毒梭菌、布鲁氏菌、猪链球菌、霍乱弧菌、土拉弗菌、鼻疽假单胞菌(或类鼻疽假单胞菌)、贝纳柯克斯体、嗜肺军团菌。

在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。

在另一优选例中，所述的引物集包括：