[发明专利]探针法检测CHO细胞DNA含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测CHO细胞DNA(即中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA)含量的方法。

背景技术

基因工程领域所用基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟和完善。因此，通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术，目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，70％来自于哺乳动物细胞，而这其中CHO细胞是最常用的细胞系。为了确保治疗性重组蛋白质药物的产品质量，欧美食品和药品管理局以及我国国家食品药品监督管理局都对药品中宿主细胞残留DNA量提出了明确的要求。分子杂交分析以及immunoassay分析具有灵敏度低、耗费时间长、不易定量检测等缺陷。

基因拷贝数是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在基因组中出现的次数。对CHO细胞基因工程细胞株进行基因拷贝数的分析对于评价基因工程细胞株的稳定性、遗传特性具有重要的意义。而选择合适的内参是准确分析某一特定基因拷贝数的基础。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确、自动化程度高和实时性等特点。Taqman探针是基于与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对的一类寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’端，而淬灭基团则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。Taqman探针技术因其灵敏度较高，特异性强，是目前备受推崇的荧光定量PCR使用技术。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

本发明的荧光PCR方法采用Taqman探针技术，克服传统检测方法灵敏度低、实施费用高等缺点，提供一种简单、廉价、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的方法，本方法可用于检测治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品CHO细胞残留DNA，从而对重组蛋白质药物生产过程进行质量监测。

本发明采用GeneBank登录号为EF540878.1的核苷酸序列，设计特异引物和Taqman探针，以提取的CHO细胞基因组DNA为模板进行荧光定量PCR。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种荧光定量PCR检测CHO细胞DNA的方法，采用GeneBank登录号为EF540878.1的核苷酸序列设计特异性引物对及Taqman探针，对待测样本提取DNA后进行实时荧光定量PCR，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

所述待检样本可为但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗或单克隆抗体。

所述的特异引物对序列为：

Primer-F的核苷酸序列为：5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3’(SEQ ID NO：1)；

Primer-R的核苷酸序列为：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：2)；

所述Taqman探针序列核苷酸为：

Probe：5’-CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3’(SEQ ID NO：3)。

其中所述Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，荧光报告基团优选为FAM，也可为其它具有相似功能的基团，3’端标记有淬灭基团，淬灭基团为MGB或BHQ1，也可为其它具有相似功能的基团。