[发明专利]胞苷三磷酸的基因工程制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞苷三磷酸的制备方法，具体地说涉及在大肠杆菌中同时高效表达大肠杆菌嘧啶代谢途径中的乳清苷酸焦磷酸化酶(pyrE)、乳清苷酸脱羧酶(pyrF)、尿甘酸激酶(pyrH)、核苷二磷酸激酶(ndk)和CTP连接酶(pyrG)基因，属于生物技术领域。

背景技术

胞苷三磷酸(cytidine triphosphate，CTP)，又称胞嘧啶核苷三磷酸，CTP经尿苷三磷酸(uridine 5′-triphosphate，UTP)由酶催化合成，是一种在胞苷的核糖-5′-OH基上结合三分子磷酸的核苷酸。胞苷三磷酸是一种高能磷酸化合物，在体内参与核酸和磷脂类的合成代谢，促进蛋白质的合成，并提供能量，是RNA生物合成的直接前体之一，并参与多糖的合成。CTP具有激活和促进受损神经组织再生和修复的功能，可健全和调节神经组织、改善脂肪代谢等作用，还可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而起到抗血管硬化的作用。国外有实验研究已证实了CTP能减轻甚至逆转多种原因所引起的神经系统损伤。CTP也是合成寡聚糖、胞苷二磷酸胆碱(CDP-胆碱)、CMP-NeuAc(CMP-N-乙酰神经氨酸)等多种药物的中间体。

近年来用于临床的药用CTP为三磷酸胞苷二钠(cytidine 5′-triphosphatedisodium)，其化学名称为胞嘧啶核苷-5′-三磷酸二钠盐，其分子式为C₉H₁₄N₃Na₂O₁₄P₃，分子量为527.14，是一种治疗脑血管疾病的核苷酸类药物。目前已有厂家生产注射液制剂，临床上主要用于治疗多种原因引起的神经系统及心血管类疾病，如脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；神经官能症；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全等。

已报道的胞苷三磷酸的合成工艺方法主要包括化学法、生物合成法、光合磷酸法等几种。国内生产CTP的方法主要是通过分离出酵母体内的自身酶系通过对CMP进行转化来生产CTP，生产工艺比较成熟。但该工艺不太可能完全分离出糖酵解系统中的所有酶，酶失活率高，转化率受到影响，且转化时间较长。近年来，CTP需求量的增加，临床用量也显著增加，已无法满足市场需求。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有的生产胞苷三磷酸的方法存在的缺陷，而提供一种新的工艺简单、生产周期短、低成本的使用酶工程法生产胞苷三磷酸的方法。

本发明胞苷三磷酸的基因工程制备方法是采取以下技术方案实现的：

胞苷三磷酸的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化氯化铵、乳清酸等底物进行反应，使得反应液中生成和积聚胞苷三磷酸，并从所述反应液中提取所述胞苷三磷酸。

前述的基因工程菌具有可诱导表达编码乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸连接酶的基因。

前述的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上。

前述的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色体上。

前述的可诱导表达所述胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段来源于大肠杆菌，是根据大肠杆菌全基因组序列(genebank登录号：ECK3632)设计引物扩增得到的。

更进一步地，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

a)将来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因核苷酸片段经酶切后与质粒载体(pUC18)连接形成重组质粒；

b)将来源于大肠杆菌的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段经酶切后插入到宿主细胞的染色体上；

c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。

胞苷三磷酸的基因工程制备方法与现有技术相比，有如下优点：

(1)采用单一的微生物工程菌株催化反应，发酵、反应条件更易于控制；

(2)所使用的底物为乳清酸，成本较低，可低成本生产胞苷三磷酸；

(3)反应迅速、且转化率较高。

以下便结合实施例并附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述。

附图说明