[发明专利]定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定点单取代聚乙二醇化Exendin类似物、其制备方法和医药用途。

背景技术

早在上世纪60年代，麦金太尔和埃尔里克等人就发现，口服葡萄糖对胰岛素分泌的促进作用明显高于静脉注射，这种额外的效应被称为“肠促胰素效应”。而珀利等人进一步研究证实，这种“肠促胰素效应”所产生的胰岛素占进食后胰岛素总量的50％以上。1986年，瑙克等人发现，2型糖尿病患者肠促胰素作用减退。这提示，肠促胰素系统异常可能是2型糖尿病的发病机制之一。

随着细胞和分子生物学的发展，肠促胰素这层神秘的面纱被慢慢揭开。研究证实，肠促胰素是人体内一种肠源性激素。在进食后，该类激素可促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。肠促胰素主要由GLP-1和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)组成，其中GLP-1在2型糖尿病的发生发展中起着更为重要的作用，它能够通过促进胰岛素分泌、刺激胰岛β细胞增生、阻止胰岛β细胞凋亡、抑制胰高血糖素的释放、抑制胃肠道蠕动和胃液分泌、延迟胃排空、产生饱胀感和食欲下降等多重途径来控制血糖。但是由于其在体内会迅速被DPP-IV降解，半衰期只有1-2分钟，限制了其应用开发。

exendin-4是从美洲毒蜥的唾液中分离得到的含有39个氨基酸序列的GLP-1类似物，其与GLP-1有53％的结构同源性，能够与GLP-1受体结合。通过与GLP-1受体结合发挥促胰岛素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用于治疗二型糖尿病。与GLP-1相比由于其第二位的丙氨酸改为了甘氨酸，避免了体内二肽酶(DPP-IV)的降解，半衰期较GLP-1的1-2min提高到2-4h，使得其得以被开发成上市产品(Byetta，Amylin公司)，每日给药两次。

然而频繁的注射给药病人顺应性很低，因此对于此类药物缓释剂型的研究和开发从未停止：NoVo Nordisk开发的liraglutide(NN-2211)每天给药一次。Amylin研究开发的exenatide LAR(PLGA微球)，每周给药一次。因此，研究开发长效制剂或者非注射途径给药的制剂是该类药物发展的趋势。

目前研究最充分的，使用的最广泛的多肽蛋白药物长效制剂技术即是聚乙二醇化技术，其使用活化的聚乙二醇试剂与多肽蛋白上特殊的氨基酸残基发生反应，形成新的分子，利用聚乙二醇的水溶性大分子特点增加多肽蛋白的溶解度，降低其免疫原性，减少肾小球滤过从而延长体内半衰期，达到延长药物作用时间的目的，提高病人顺应性。

聚乙二醇化技术一般使用活化的聚乙二醇化试剂与多肽或蛋白结构上的活泼残基(按活性顺序一般为巯基，氨基，羧基等)进行反应，形成化学键稳定的聚乙二醇化产物。但是结构上具有多个活泼残基时，一般生成不同位点的单取代混合物，并且在聚乙二醇摩尔比例较高时还会继续形成多取代产物。一般多取代物会显著影响药物活性，进而影响体内药效，而且多取代物的质量控制也比较困难，因此上市的聚乙二醇化药物基本都是单取代物。

由于单取代的位置对于多肽或者蛋白类药物的活性影响非常显著，因此制备活性位点最佳的单取代聚乙二醇化产品很有必要。

现有技术中，定点化聚乙二醇化的常用技术有两类：

一类是控制结构上能够反应的残基数。这类技术中，比较多的方法是是在位置最佳处突变产生或者合成中加入一个半胱氨酸，然后利用能够与巯基反应的聚乙二醇化试剂(如聚乙二醇化马来酰亚胺)进行反应，在半胱氨酸上结合聚乙二醇。然而这种方法的缺点一方面是药物结构改变造成对其药效及毒性的影响不清楚，二是引入了半胱氨酸，对于其稳定性会有不利影响，比如说半胱氨酸易氧化。另外的定点方法则是采用赖氨酸氨基作为聚乙二醇化位点，其将其它位点的赖氨酸全部替换为碱性精氨酸，仅留下需要反应位点的赖氨酸。这样的方法缺点同样是结构改变会对药效及毒性产生明显影响，本申请的发明人在实验中即有明确发现这样改变结构的新多肽药效受到很大影响。

另一类技术则是在偏酸性条件下使用聚乙二醇丙醛试剂对N端氨基进行聚乙二醇化修饰。有研究者发现N端氨基pKa值小于赖氨酸残基上的氨基，也就是说碱性更强。因此，赖氨酸上的氨基需要在微碱性条件下(pH7-8)发生聚乙二醇化反应，而N端氨基可在偏酸性条件下(pH 5-6)即发生聚乙二醇化反应，而此时赖氨酸上的氨基不能反应。因此有研究者利用多肽或者蛋白的上述性质，在偏酸性条件下对N端氨基进行定点的聚乙二醇化反应。但是这种方法有两个缺点，一是不适用于N端为活性位点的药物；二是此反应得率低，在聚乙二醇试剂使用摩尔比高达5甚至10的条件下，而产率也仅有50％-60％，导致生产成本太高，不具备生产的可能。