[发明专利]用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法

权利要求书

1.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物，其特征是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下四对引物：

第一对是F1片段的引物F1f和F1r，其中：

F1f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC

F1r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG

第二对是F2片段的引物F2f和F2r，其中： 

F2f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG

F2r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA

第三对是F3片段的引物F3f和F3r，其中：

F3f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC

F3r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG

第四对是F4片段的引物F4f和F4r，其中：

F4f的序列为：

CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT

F4r的序列为：

CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。

2.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，其特征是采用权利要求1所述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用454测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是按下列步骤顺序进行：

a. 提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；

b. PCR反应：

以步骤a中提取的DNA为模版，分别用F1片段的引物F1f和F1r，F2片段的引物F2f和F2r，F3片段的引物F3f和F3r，F4片段的引物F4f和F4r进行PCR，

在PCR管中加入下列物质：10×PCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1 uL，浓度为20umol/L PCR引物f 1uL，浓度为20umol/L PCR引物r 1uL，高保真DNA聚合酶0.5 uL，DNA模板 2 uL和超纯水39uL，

将PCR管放入PCR仪中进行扩增反应，所得产物中含有PCR扩增的目标基因片段；

c. 获取样本库：

对步骤b中获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒回收目的片段，其中F1片段大小为480bp，F2片段大小为466bp，F3片段大小为457bp，F4片段大小为383bp；用Nanadrop紫外分光光度计检测回收到的片段的浓度，将四种片段以等摩尔比混合构成样本的逆转录酶基因文库；

d. 测序：

采用454测序技术对逆转录酶基因文库进行测序，检测是否存在15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变的一种或者几种，这15种位于转录酶基因上与乙型肝炎病毒耐药性相关的突变分别是：L80V/I，I169T，V173L，L180M，A181T/V，T184S/A/I/L/F/G，A194T，S202G/I，M204V/I/S，N236T，M250V，Q215S，V84M，S85A和V214A。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤b中，进行扩增反应的条件是：b1. 94℃ 5分钟； b2. 94℃ 30秒； b3. 57℃ 30秒； b4. 72℃ 30秒； b5.重复29次步骤b2～b4；b6. 72℃ 10分钟；b7.降温至4℃。