[发明专利]利用维管特异启动子控制人工合成的抗菌肽基因的植物表达载体及其培育抗黄萎病棉花的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及维管特异启动子控制人工合成的抗菌肽基因植物表达载体和含有上述表达载体的转基因棉花制备方法；此外，本发明还涉及一种利用基因工程技术提高棉花对黄萎病抗性的方法。

技术背景

棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是我国关系国计民生的重要物资，棉花产业对我国纺织工业乃至整个国民经济发展都具有举足轻重的作用。但是，棉花黄萎病自1935 年传入我国以来，对我国棉花生产的危害逐年加重。黄萎病已成为当前棉花实现高产、稳产的主要限制因素。该病属土传维管束病害，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、病原菌存活时间久，是棉花生产中最具毁灭性的病害之一。更重要的是我国主栽的陆地棉品种缺乏高抗黄萎病的种质资源，生产上一直没有找到能根治的措施，因此，黄萎病被称为棉花生产的“癌症”。生产实践证明，选育和推广抗病品种，是防治黄萎病最经济有效，而且是唯一有效的途径（顾本康等，1996）。

历经几十年的努力，利用常规育种手段，我国获得了部分对黄萎病具有一定抗病能力的地方品种，但是由于黄萎病菌变异快、小种多、具有明显的致病力分化，针对黄萎病菌这种特性的广谱抗性棉花品种基本没有，因此在一个地区表现为抗病的棉种，到不同生理和地理条件下，就出现抗病性丧失的现象。另一方面，陆地棉栽培种内高抗黄萎病的抗源缺乏，直接导致了我国棉花抗黄萎病育种进程缓慢，特别是抗落叶型黄萎病育种基本没有进展。为此，解决生产中抗黄萎病资源缺乏的问题和寻找新的抗病育种方法已迫在眉睫，急需获得具有广谱和持久抗性的抗源以减轻棉花生产中黄萎病造成的巨大损失。

随着分子生物学的发展，利用基因工程分离、克隆和转化抗性基因，不仅可以定向性地改良植物的抗病性，而且基因型来源丰富，不受抗源亲缘关系限制，育种周期短，理论上不存在性状负相关连锁，一次克隆亦可用于多次转化。因此，采用生物技术等多种育种方法，加快抗黄萎病育种进程成为必然。

抗菌蛋白或抗菌肽（AMP，antimicrobial protein or peptide）是一类由生物产生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，广泛分布于动物、植物和微生物中，具有抗菌谱广、抗菌活性高和抗性持久等特点。另外，抗菌肽的抗菌机制特别，多以在膜上形成孔道导致细胞内容物泄漏的方式摧毁病原菌，致使病原菌难以产生抗性（Yeaman等，2003）。因此，利用抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性受到广泛关注。植物抗病分子育种策略中，利用来自植物的抗菌蛋白或抗菌肽提高植物的抗病性是最常用的方法之一，因为植物来源的抗菌肽转入植物中更易于受体植物的识别和整合。但是植物来源的抗菌肽转入植物后病原菌易产生抗性或具有病原特异性，因此，要获得对不同生理小种的黄萎病菌具有广谱和持久抗性相对比较困难。而人工合成的非植物源的抗菌蛋白或抗菌肽却能克服植物源抗菌肽的这种不足，但是这类抗菌蛋白或抗菌肽可能会严重影响植物的生长发育。比如，郭余龙等（2003）利用基因枪将抗菌肽基因CEMA转入棉花，转基因棉花叶片呈黄绿相间的条纹状，电镜扫描结果显示，CEMA抗菌肽严重影响叶绿体片层结构。

植物基因工程中，控制基因表达启动子的选择方面，常常首先选用组成型表达的CaMV35S启动子，实现外源基因超量表达以研究基因的功能。但是，具体到抗病基因工程，常常根据不同病害的特点，组织特异或诱导表达所需要的目标抗菌蛋白或抗菌肽，以抵抗病原菌的入侵或抑制病原菌的生长。如，Rajesh Narhari Patkar（2006）等，利用诱导型启动子PAL调控ns-LTP-like基因在水稻中表达，有效提高了转基因水稻对稻瘟病等多种病害的抗性。棉花黄萎病菌主要从植株的根部开始侵染，然后随着植株根、茎和叶片各部位的维管组织向植株上部逐渐扩展，条件合适的情况下，可以发展至植株顶部，造成整个植株发病甚至死亡，造成严重减产和降低纤维品质。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种既能提高植物的抗病性，又不影响植物生长发育的利用维管管特异启动子AAP2控制人工合成的抗菌肽基因spCEMA的植物表达载体。

本发明利用基因工程方法，将AAP2启动子和spCEMA抗菌肽基因同时构建入适宜的表达载体内，即获得了本发明的AAP2启动子控制抗菌肽基因的植物表达载体。获得的植物表达载体具有图3 P5-AAP2-spCEMA所示的结构特征。将这个载体转入植物内，即可获得维管特异表达spCEMA基因的转基因植物。