[发明专利]全基因组mRNA3′末端基因文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因文库的构建方法，尤其涉及一种适用于高通量测序的全基因组mRNA 3′末端文库的制备方法。

背景技术

3’非翻译区(简称3’UTR)是信使RNA(mRNA)的一个特殊部分，位于基因编码区的3’末端。3’UTR是mRNA功能的重要调控元件，具有如下调控序列：多聚腺苷酸化位点，通常为AAUAAA；蛋白结合位点和miRNA靶标位点等。3’UTR不仅可以控制mRNA的体内稳定性和降解速率、调节mRNA亚细胞定位和翻译水平，还能决定其所表达的细胞种类、控制mRNA的利用效率、协助辨认特殊密码子。3’UTR的突变可以影响一或多个基因的表达，从而导致疾病的发生。人类基因往往有多个多聚腺苷酸化位点，在不同位点发生多聚腺苷酸化从而产生不同长度的3’UTR是人类基因转录中的普遍现象，也被认为是可选择性剪切的类型之一-串联3’UTRs(tandem 3’UTRs)。3’UTR长度受到精确的调控，一个基因3’UTR长度的改变会引起多个基因的表达改变，会对细胞的调控网络及生理功能造成重大影响。对酵母、果蝇及人类基因组的3’UTR多态性长度已成为当前的研究热点之一，如Sandberg等通过基因芯片技术对mRNA进行分析发现，增殖的CD4+淋巴细胞中存在较多的具有短的3’UTR的转录本，强迫表达全长的3’UTR会造成蛋白表达量的减少。经过实验证明，具有短的3’UTR的转录本的大量存在可能是由于较短的3’UTR含有比较少的microRNA结合位点而减弱了microRNA的调控作用造成，暗示了我们3’UTR长度多态性可能参与调控了细胞的增殖。

基因芯片及大规模测序技术已经被应用于全基因组3’UTR长度多态性研究。但是，基因芯片受到技术本身的限制，对研究3’UTR长度多态性有一些不利因素：1)基因芯片技术过于依赖于现有的基因组信息，无法发现新的多聚腺苷酸化位点、3’UTR区域序列的突变；2)由于基因芯片荧光信号采集的需要，如需要较多的RNA样本，不利于较难获得的样本的研究；3)基因芯片的杂交信号易被背景干扰、检测基因表达量有上限和下限，限制了其敏感度，因此使用基因芯片进行分析实验的重复性较差。大规模测序技术也被广泛应用在转录组研究中，但对于UTR区域的研究来说，依然存在一定缺陷。首先，RNA-seq获得的序列包括了整个转录组的信息，而UTR区域只是其中一部分，故利用RNA-seq直接对转录组进行测序无法获得足够的3’UTR的序列信息。其次，在常用的RNA-seq方案中，由于测序技术读长的限制，所获得均为打断后的转录本序列，在后期的数据处理中，需要对其进行拼接后估计基因的表达变化，存在一定局限性。

鉴于此，利用大规模测序技术的检测全基因组的3’UTR区域是非常必要的。最简单方法是利用mRNA的polyA尾进行反转录，然后直接进行测序，获得mRNA3’最末端的序列。但由于大规模测序技术原理本身的限制，这种直接测序的方法较难实现。如大规模测序技术的代表之一454的GS FLX系统采用的是焦磷酸测序技术，是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。但是如果遇到连续的几个甚至十几个碱基，可见光信号会过强，无法分辨掺入的核苷酸数目，甚至影响其他临近孔内的可见光信号的检测，造成测序失败。同样是大规模测序技术，Illumina的Genome Analyzer系统应用了边合成边测序(Sequencing By Synthesis)的原理。加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3′端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。与454的GS FLX类似，如果遇到连续的几个甚至十几个碱基，相同位置过强的荧光信号，也会影响测序的过程和结果。

发明内容