[发明专利]制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液

说明书

技术领域

本发明涉及了一种治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，特别是制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液。

背景技术

干细胞(Stem cell，SC)是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的细胞，在一定的条件下，可以分化成多种功能的细胞或组织器官，医学界称之为“万用细胞”。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是SC中的一类，它来源于发育早期中胚层，广泛存在于骨髓、骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血、脐带等多种组织中，同样具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能。目前人羊膜间充质细胞(MSCs)已成为干细胞研究领域的热点，被广泛应用于各系统疾病的治疗研究。中枢神经系统损伤后的神经修复与再生一直是神经科学研究领域的重点和难点。这是因为中枢神经系统缺乏其它系统的器官组织强大的自我修复能力，绝大多数神经元受损后不能再生，再生的细胞也不能建立正常的树突和轴突联系，从而造成不同程度的神经功能障碍，影响中枢神经系统的各种调节功能。近年来，随着医学的快速发展和干细胞研究的不断深入，基因治疗、移植免疫学和发育生物学等学科间相互渗透与促进，干细胞在神经系统损伤中的修复作用越来越备受关注。

由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞抗原(HLA)--A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细胞是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和NK细胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人羊膜间充质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等对同一条件下人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活性进行比较，发现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于 细胞接触和细胞剂量。

血管内皮细胞是组织工程化血管的核心，是血管外科和心脏外科血管移植物的主要材料。目前研究利用各种间充质细胞进行诱导分化取得了很大进展。Joachim等采用密度梯度法分离人MSCs，加入2％胎牛血清和50μg/L血管内皮生长因子(vascula r endothelialgrowth factor，VEGF)诱导7d，发现诱导前后细胞没有明显的形态学改变，但免疫组织化学提示VIII因子抗体有显著的升高，电镜可以发现Weibel-Palade小体(W-P小体)。同时，细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、VFGF受体KDR/Flt21、血管内皮黏附分子及血管细胞黏附分子。在半固体培养基中还可以形成血管腔样结构。诱导后的细胞呈梭形，传代超过5代后细胞即变宽、变平，故有关内皮细胞的研究应在第1～5代之间进行。Liang等应用VEGF和碱性成纤维生长因子诱导后发现，细胞形成血管腔样结构，周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。兔抗VEGF受体1(Flt21)最早阳性表达，随后CD34、CD31、Flt21、VIII因子抗体也阳性表达并呈逐渐增加的趋势。Gang等则提取脐血MSCs经VEGF、表皮生长因子和皮质醇激素诱导3周，同样诱导出具有内皮细胞表面标记的细胞，并发现有一些细胞因子分泌。