[发明专利]制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液

权利要求书

1.一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(2)将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/毫升-2×10⁶个/毫升；

(3)将上述人羊膜间充质细胞在-196℃至-185℃的液氮下冷冻保存；

(4)在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁷个/毫升-2×10⁷个/毫升；

(6)将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

2.如权利要求1所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，其特征在于：所述的步骤(3)包括：将在培养瓶底部融合85％以上的人羊膜间充细胞，用D-hank’s过洗2次，然后加入2毫升0.25％胰蛋白酶，待细胞60-70％缩小变圆之后，加2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液，回收细胞悬液，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉；然后加入含有10％-20％白蛋白+40％DMSO+50％DMEM/F12的冷冻液，制成细胞悬液，加入冻存管中，在冻存管上做好标记，包括细胞类型、代数、冷冻日期和细胞数，将冻存管放入-85℃的冰箱内放置3至4小时后，再将冻存管直接投入液氮中保存。

3.如权利要求2所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：所述的步骤(4)包括：将装有人羊膜间充质细胞的冻存管从液氮中取出，用镊子夹住冻存管上部在室温25℃中空气浴5秒钟；然后将冻存管投入水浴温度为37℃的水浴锅，轻轻晃动冻存管使得管壁受热均匀，随时观察人羊膜间充质细胞解冻情况，在40-85秒钟后，待冷冻液全部融化后将冻存管取出，将人羊膜间充质细胞悬液吸至10毫升DMEM/F12中，离心洗涤，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉，重复上述离心洗涤两次。

4.如权利要求3所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，其特征在于：步骤(2)和步骤(5)包括以下步骤：是分别将步骤(1)和步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和无血清培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO₂培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当60-70％的细胞变化成圆形时，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液终止消化，然后吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量。

5.如权利要求4所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：所述步骤(6)是人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，在摇动频率为30-60转/分钟的摇床上摇匀。

6.一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的注射液包括：每毫升生理盐水中含有10⁴个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

7.如权利要求6的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的注射液为静脉注射液，它被配制成100毫升的注射液，即在100毫升生理盐水中含有10⁶个至10⁷个活的人羊膜间充质细胞。