[发明专利]华重楼微卫星DNA分子标记

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种华重楼微卫星分子遗传标记。

背景技术

微卫星(Microsatellite)又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指一类遍布于生物基因组中的由几个核苷酸对(称为核心序列，一般为1～6bps)为重复单位组成的简单串联重复。其重复次数在同一物种不同的遗传型间是高度可变的，但这段重复的两端却是相对保守的单拷贝序列，据此设计引物，即可通过PCR技术分析核心序列重复次数的变异，在不同的遗传型间检测到多态。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型(pure)，复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：

单一型：ATATATATATATATATATATATAT

复合型：ATATATCACACACACACACAC

间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA

作为一种分子标记，微卫星DNA具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中，据估计每6kb长度中就有1个微卫星位点；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循盂德尔法则遗传；选择中性等等。

基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。

华重楼，又名七叶一枝花，蚤休等，为百合科重楼属多年生草本植物。该药味苦，性微寒，有小毒，归肝经。具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功 效，有药理研究表明，它还具有止血消炎、抗肿瘤、抗生育、调节免疫及心血管等多方面的生理活性。

近年来，已陆陆续续从该属植物中分离鉴定出50余种化合物，主要有C₁₇甾体皂苷、黄酮苷及多糖等。常用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、惊风抽搐等，是夺命丹、总皂苷片、云南白药、宫血宁等中成药的重要原料。

虽然其药源广，但近年来由于大量开采野生药材，民间滥挖严重，加之野生药材周期长，导致野生资源枯竭，该植物现为珍稀濒危保护植物。目前国内外对重楼属植物的研究尚且很少，重楼属植物分类这一难题至今仍为解决。

发明内容

本发明解决的技术问题：分离克隆华重楼的微卫星DNA分子标记，建立华重楼微卫星DNA技术体系并用这些分子标记进行华重楼遗传多样性，重楼属植物遗传关系的研究，以及进行华重楼种质鉴定。

本发明解决技术问题的技术方案：华重楼微卫星DNA分子标记，包括华重楼微卫星(CT)n富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到51个含有微卫星重复序列的克隆。得到12个多态性高的微卫星分子标记Ps1、Ps2、Ps3、Ps4、Ps5、Ps6、Ps7、Ps8、Ps9、Ps10、Ps11、Ps12；Ps1为386个核苷酸，Ps2为390个核苷酸，Ps3为458个核苷酸，Ps4为496个核苷酸，Ps5为447个核苷酸，Ps6为276个核苷酸，Ps7为226个核苷酸，Ps8为495个核苷酸，Ps9为274个核苷酸，Ps10为549个核苷酸，Ps11为658个核苷酸，Ps12为409个核苷酸。

附图说明

图1：Ps1位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图2：Ps2位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图3：Ps3位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图4：Ps4位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图5：Ps5位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图6：Ps6位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图7：Ps7位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图8：Ps8位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图9：Ps9位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图10：Ps10位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。

图11：Ps11位点的特异性引物扩增21个华重楼的DNA的银染PAGE图。