[发明专利]生产高纯度头孢菌素C的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程菌及其应用，特别涉及生产高纯度头孢菌素C的基因工程菌及其应用。

背景技术

头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)是工业生产头孢菌素的原料，头孢菌素属于β内酰胺类抗生素，是一类具有重要应用价值的广谱抗生素。头孢菌素C的工业生产菌是顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)。头孢菌素C在顶头孢霉菌中的生物合成途径已经研究得十分清楚，为利用基因工程手段改造顶头孢霉菌奠定了良好基础。去乙酰氧头孢菌素C(Deacetoxycephalosporin C，DAOC)是头孢菌素C生物合成过程中的一种中间产物。在生物合成中，青霉素N(penicillin N)被由基因cefEF编码的扩环/羟化双功能酶催化，首先扩环生成DAOC，然后羟化生成DAC(Deacetylcephalosporin C)。在工业发酵生产过程当中，DAOC会累积在发酵液中，占终产物CPC总量的1％到2％之间。当CPC作为原料进入下游化学合成头孢菌素的过程中，DAOC也会相应的变成无法去除的杂质，影响到产品的纯度。

蛋白cefF的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

发明内容

本发明的一个目的是提供顶头孢霉cefF基因工程菌(Acremonium chrysogenum)，其保藏号为CGMCC No.4515。

本发明的另一个目的是提供一种基因工程菌。

本发明所提供的基因工程菌，为将如下融合基因导入宿主菌得到的基因工程菌：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。

所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；

所述宿主菌为顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)；

所述融合基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。

所述重组表达载体为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；

所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。

所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述基因工程菌在生产头孢菌素C中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供含有如下融合基因的重组质粒：序列表中序列1中第7-1194位核苷酸所示DNA片段与蛋白cefF的编码基因构成的融合基因。

所述重组质粒为将所述融合基因插入表达载体pAg1-H3的多克隆位点得到的重组表达载体；

所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示；

所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示。

蛋白cefF或蛋白cefF的编码基因在用发酵菌制备头孢菌素C的过程中降低产物中去乙酰氧头孢菌素C的产量中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白cefF的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1中第1203-2275位核苷酸所示。

本发明的又一个目的是提供一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：发酵所述顶头孢霉cefF基因工程菌或所述工程菌，得到头孢菌素C。

本发明将带有顶头孢霉菌启动子PpcbC的棒状链霉菌来源的基因cefF转入顶头孢霉菌中，使其在体内转录表达，增强DAOC羟化生成DAC这一催化反应，从而降低发酵产物中DAOC的量，达到提高工业产品CPC纯度的目的。

附图说明

图1为PCR扩增PpcbC产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为PCR扩增cefF产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为重组质粒pAg1-H3-cefF的构建。

图4为PCR验证基因工程菌株的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

图5为野生型菌株中DAOC与CPC的检测结果图。

图6为基因工程菌株中DAOC与CPC的检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、生产高纯度头孢霉素的基因工程菌及其应用

顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CGMCC 3.3795购自中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)；

棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)ATCC27064购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。