[发明专利]一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所致的一种传染性疾病。据世界卫生组织(WHO)提供的数据，2002年世界结核病的形势为：感染人数约30亿，新发结核病例880万。其中，新涂阳结核病例390万，发病率比2001年增长1.1％，新发病例中耐多药比例为3.2％，结核病的死亡人数达180万。回顾性调查结果表明，中国MTB的总耐药率为27.8％，初始耐药率和获得耐药率分别为18.6％和46.5％，耐多药率为10.7％，其中初始和获得性耐多药率分别为7.6％和17.1％。由于耐药结核杆菌的流行，使结核病成为由单一微生物导致死亡的主要原因，占世界人口数的7％，占可预防死亡数的26％。

随着分子生物学理论和技术的发展，MTB的耐药机制及耐药的分子基础逐步被阐明，建立了快速检测MTB耐药基因的方法，为MTB快速药物敏感性试验开辟了一条新的途径。研究表明MTB产生耐药性机制包括药物失活酶、胞壁通透性改变、靶结构基因突变和代谢途径改变等，而主要机制是菌内药物作用靶基因的突变所致。利福平和异烟肼是治疗结核最主要的一线药物，通过各种分子生物学工具对这两种药物的耐药性的遗传基础进行了深入研究，结果显示，在正常情况下，利福平(RFP)与RNA聚合酶B亚基(rpoB)特异性结合，通过阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用，rpoB基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的rpoB亚基构象，从而降低与利福平的亲和力。rpoB基因突变一般发生在该基因内一个高度保守的81bp区域内(507-533位27个氨基酸密码子)。其中最常见的密码子突变点为531位丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)(531TCG→TTG)，526位组氨酸(His)→酪氨酸(Tyr)(526CAC→GAC)，此外，常见的点突变还有511CTG→CCG，533CTG→CCG(Taniguchi H.Molecularmechanisms of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis[J].J Uoch，2000，22(3)：269-282)。

异烟肼耐药性的分子基础比较复杂，已发现几个涉及异烟肼体内代谢过程中活性中间体形成有关的基因，其中与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因katG和/或烯酰基还原酶编码基因inbA等基因突变有关。这两种酶都直接或间接的参与异烟肼中间体的形成。

katG基因常见的密码子突变点为第315发生突变(315AGC→ACC、315AGC→AAC，Herrara L，Valverde A，Saiz P，et al.Molecular characterization ofisoniazid-resistant mycobacterium tuberculosis clinical strains isolated inthe Philippines[J].Int J Antimicrob Agents，2004，23(6)572-576.)它的发生频率约为67.2％。inhA基因的耐异烟肼突变主要发生在其启动子区的-15T位脱氧核糖核苷酸(inhA基因在其启动子区的-15C突变为T，Basso LA，Zhang R，Musser JM，et al.Mechanisms of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis：enzymatic characterization of enoyl reductase mutants identified inisoniazid-resistant clinical isolates[J].J Infect Dis，1998，178(3)：769-775.)上。

结核分枝杆菌的临床检测一直以来主要依靠药物敏感试验，但传统的在固体培养基上进行的药物敏感试验周期长。敏感性低，严重影响了患者的早期诊断和治疗。

生物学方法为耐药结核病的快速检测打开了广阔的前景。在许多的核酸扩增方法中，PCR方法被最广泛地应用于临床结核的检测。

目前常用的结核杆菌基因突变检测方法如下：

(1)DNA测序法(DNA sequencing)对耐药基因片段的PCR产物进行直接测序，然后与标准敏感菌株的同一DNA片段比较，分析碱基突变的位置与分布，但是此方法比较繁琐，且所需设备多集中在一些大的测序公司，难于普及。