[发明专利]一种利用食品级启动子表达牛肉风味强化肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域中一种表达牛肉风味强化肽的食品级载体和工程菌。

背景技术

牛肉风味强化肽(Beefy Meaty Peptide，BMP)最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到，其一级结构为：Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-leu-Ala。BMP与食盐、MSG有较好的协同呈味的作用，并且具有很好的热稳定性，适合于食品工业生产中的热处理要求。因此，BMP有望代替MSG成为新一代风味强化剂，具有广阔的市场前景。

毕赤酵母是一个理想的外源蛋白表达体系，它具有真核生物表达系统的特点，能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工；能进行大体积高密度连续发酵培养；自身分泌蛋白少等优秀的特点。诱导毕赤酵母表达系统已经实现了400多种蛋白的表达，并且广泛地应用在工业大规模生产和实验研究中。

毕赤酵母具有较强的醇氧化酶基因(alcohol oxidase，AOX)启动子，可在甲醇诱导下严格控制外源基因的表达，然而AOX启动子需要甲醇诱导存在食品安全的隐患，需要开发一种没有毒害的诱导物或表达方式。

本发明利用组成型、半乳糖诱导型启动子进行对牛肉风味强化肽的表达进行调控，该启动子不需要甲醇或其它有害物质诱导就可进行对外源基因的表达。

发明内容

本发明的一个目的是通过对成熟毕赤酵母表达体系中启动子的改造，构建成一个无毒害、更安全的微生物食品级表达体系。

本发明所提供表达体系是通过将食品级表达载体整合毕赤酵母而构建完成的。

所述的表达载体含有串连多拷贝的牛肉风味强化肽表达基因和组成型启动子、半乳糖诱导型启动子。

所述巴斯德毕赤酵母表达载体为可为pPIC9、pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pHIL-D2、pPICZA、pPICZAB、pPICZAC、pPIC9K、pACO815、pPICZetA、pPICZetB、pPICZetC或pHIL-S1。

所述巴斯德毕赤酵母表达载体优选为pPIC9。

所述组成型启动子、半乳糖诱导型启动子，其特征在于：所述表达启动子为GAP、PGK1、YPT1、TPI1、ENO1、HSP82、SSA4、KAR2、RSP7、RSP2、REP31、PET9、TEF1、THI11、GAL1。

所述巴斯德毕赤酵母表达载体启动子优选为GAP。

所述多拷贝的牛肉风味强化肽表达基因为串联多拷贝。

所述多拷贝的牛肉风味强化肽表达基因优选为16拷贝。

含有上述表达牛肉风味强化肽的巴斯德毕赤酵母表达菌株也属于本发明的保护范围。

本发明针对牛肉风味强化肽来源少、生产成本高的问题，通过构建工程菌，将多拷贝串连的牛肉风味强化肽表达基因和组成型表达启动子GAP与酵母表达载体pPIC9连接，与毕赤酵母基因组整合，获得了能高效表达牛肉风味强化肽的工程菌。本发明的生产方法目的性强，产品纯度高，产量高，产品性状稳定，提供了一种大规模廉价生产牛肉风味强化肽的方法。

本发明的实验方法如下：

1、组成型表达载体的构建：

首先以毕赤酵母基因组为模板，PCR得到组成型启动子GAP的序列，通过EcoR I、Not I两个限制性酶切位点将pPIC9质粒的甲醇诱导启动子AOX换成组成型启动子GAP。

2、表达载体整合酵母染色体：

将构建好的表达质粒用SacI线性化后电击转化进入毕赤酵母与其基因组进行整合，构建成组成型毕赤酵母表达体系。在YPG培养基中，通过摇瓶发酵得到目的蛋白牛肉风味强化肽。

3、中空纤维超滤浓缩发酵液中的BMP：

发酵原液离心后获得的上清液经过60kDa中空纤维超滤膜，除去菌体碎片和大的杂质。16BMP的分子量是16kD，所以再选择截留分子量为6000D的超滤膜进行浓缩，这样，既不损失过多的蛋白，又会除去盐和小分子杂质。表达发酵液通过中空纤维超滤膜，使发酵液体积浓缩20倍。

由此证明，中空纤维超滤膜可以高效的浓缩发酵液，使目的蛋白浓缩，为进一步的提纯工作提供了时间及空间的节省作用。

具体实施方案

为了理解本发明，下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施案例1：

用一对引物从毕赤酵母染色体中PCR得到的组成型启动子GAP目的片段。

PCR反应体系及程序如下：