[发明专利]α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体及其应用和所用多肽

说明书

技术领域

本发明涉及一种α1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体及其应用。

背景技术

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin，α1-AT)是由肝脏产生的一种糖蛋白，是人类血浆中最重要的蛋白酶抑制剂，能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶、凝血酶、血浆素、胰蛋白酶等，它占血浆总蛋白酶抑制能力的90％以上。

α1-抗胰蛋白酶的主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤并抑制感染和炎症，从而维持机体内环境的平衡。而α1-抗胰蛋白酶缺乏则会导致一些疾病的发生，如肝脏硬化。因为部分变异型α1-抗胰蛋白酶在合成过程中分泌到血液中，而大部分则在其糖基化过程中停止下来并在内质网上沉积，从而导致肝细胞损伤，引发肝脏硬化。

原发性肝癌是严重威胁我国人民生命健康的恶性肿瘤，总体疗效差、死亡率高。据世界卫生组织统计，全球每年新发肝癌病例100万至150万例。因为我国是肝炎大国，居民卫生意识和健康意识薄弱，所以我国肝癌发病人数占全球的55％，死亡人数占全球的45％。由于缺乏较好的早期诊断方法，临床上发现多为晚期，因此新的肝癌早期诊断方法的开发成已成为我国迫切的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于人类的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体及其制备方法中所用的多肽，以及该α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于制备α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的多肽，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还同时提供了一种α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体，其利用上述多肽制备而得。

作为本发明的α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体的改进：多克隆抗体为α1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体。

本发明还同时提供了上述α1-抗胰蛋白酶多克隆抗体在制备肝癌早期诊断剂中的应用。

本发明以SEQ ID NO：1所示的多肽为抗原免疫动物，获得了多克隆抗体，该多克隆抗体为抗α1-抗胰蛋白酶的抗体。

本发明所述人α1-抗胰蛋白酶的多克隆抗体为兔的血清免疫球蛋白IgG，该抗体能特异性识别并结合α1-抗胰蛋白酶，可以有效应用于检测α1-抗胰蛋白酶的多种方法，如ELISA、westernblot、免疫组织化学等检测，通过免疫组织化学实验证明，α1-抗胰蛋白酶在肝癌中表达较癌旁组织中明显减低。本发明为了解α1-抗胰蛋白酶的功能和它对慢性乙型肝炎发病的影响提供了重要的研究工具和基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明实施例1的人α1-抗胰蛋白酶的亲水性、抗原性和表面暴露性分析图；

图2是本发明实施例3的α1-抗胰蛋白酶的编码序列电泳图谱；

图3是本发明实施例3的α1-抗胰蛋白酶-pcDNA 3.1A的酶切鉴定图；

图4是本发明实施例3的western blot对纯化的抗体进行鉴定图；

图5是本发明实施例4的肝癌和正常肝组织的免疫组化图。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法。

实施例1、利用DNA star分析软件对α1-抗胰蛋白酶蛋白进行分析(图1)并筛选α1-抗胰蛋白酶蛋白中一段多肽来制备多克隆抗体，基本原则如下：

1)、具有较高的亲水性，抗原性而且表面暴露性强；

2)、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；

3)、特异性较强的肽段；

4)、不形成α-helix；

5)、抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间。

筛选出用于制备α1-抗胰蛋白酶蛋白多克隆抗体的多肽序列为CENEDRRSASLHLPK(SEQ ID NO.1)。多肽合成后，经SDS-PAGE电泳纯化，纯度≥90％，并与KLH(钥孔嘁血蓝蛋白)偶联。

说明如下：上述序列中的C是用来多肽交联KLH和BSA的，其余序列同α1-抗胰蛋白酶蛋白中的一段序列。

实施例2、制备α1-抗胰蛋白酶蛋白的多克隆抗体

1)、免疫计划与方案如下：

将实施例1所得的多肽抗原对2只2.5kg左右的成年雄性新西兰大白兔分别注射进行免疫：

A.第1天，首免：500ug多肽-KLH(500ul)+CFA(弗氏完全佐剂)500ul；

B.第21天，二免：250ug多肽-KLH(500ul)+IFA(弗氏不完全佐剂)500ul；

C.第35天，三免：250ug多肽-KLH(500ul)+IFA 500ul；