[发明专利]大豆ADF基因及其在花器官改造中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一个大豆ADF基因GmADF1的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中广泛存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统。肌动蛋白骨架对植物高度特异化的细胞如花粉管、叶毛、根毛和气孔保卫细胞的形态发生和功能起着重要作用，同时在高等植物形态发生的细胞分裂和伸长过程中发挥着极为关键的调节作用 (Kostet al.,1999; Dong et al.,2001)。ADF（actin depolymerizing factor）作为一种重要的肌动蛋白结合蛋白，自从1997年Carlier克隆第一个拟南芥ADF1后，越来越多的植物ADF被克隆。众多研究表明ADF可调节肌动蛋白聚合和解离，参与植物细胞形态建成，从而起到调节植株性状的作用，为筛选特定性状的植株提供了理想的候选调控基因。

大豆起源于我国，是重要的粮油兼用作物。大豆作为严格自花授粉的作物，其花器较小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，导致花药和柱头不能外露，故造成大豆异花传粉非常困难，同时也使得大豆的杂种优势很难被利用。若能定向改变大豆的花器官结构，使之更利于接受外源花粉，必将大大降低不育系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产得以实现。因此，从分子水平上挖掘能够影响和控制细胞形态建成的相关基因，并应用于特定器官的改造，如大豆的花器官，具有重要的理论和现实意义。本发明从大豆中克隆了1个影响花瓣位置和数目的基因GmADF1，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的旨在公开GmADF1在花器官改造中的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，从而进行植物品种改良。

技术方案

本发明所提供的大豆ADF基因，其核苷酸序列为：SEQ ID NO. 1，其表达蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。

大豆ADF基因GmADF1的基因工程应用，包括：

1）大豆GmADF1的克隆

搜索大豆EST库,设计一对引物如下:

上游引物: 5'-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3'，见SEQ ID NO. 3；

下游引物: 5'-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3'，见SEQ ID NO. 4；

提取大豆品种N2899叶的总RNA, 经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包含模板cDNA 1.0 μL(50ng.μL^-1)，10×Taq 缓冲液2 μL,MgCL₂ 1.2 μL(25 mmoL.L^-1),dNTPs0.5 μL (10 mmoL.L^-1), Taq聚合酶0.5μL (5 U.μL^-1)，上游引物，下游引物各1.0 μL (10pmoL.μL^-1)，用ddH₂O补齐至25 μL。PCR反应程序为: 95℃预变性4 min, 反应共30个循环包括95℃变性50s, 56℃退火50s, 72℃延伸1min,最后72℃保温10 min。再将PCR产物进行克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆GmADF1的cDNA序列SEQ ID NO. 1；

2）植物表达载体的构建

运用Gateway技术可以快速并高效地将目的序列同时构建到多种与Gateway 技术兼容的载体系统，用于功能分析和蛋白质表达研究。其基本过程如下：根据Gateway说明书设计一对过量表达的特异性引物：

上游引物：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACG

CAGCATCTGGTATGGC -3'，见SEQ ID NO. 5；

下游引物：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGC

TTTTGAACAC -3'，见SEQ ID NO. 6；