[发明专利]大豆ADF基因及其在花器官改造中的应用

权利要求书

1.一种大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。

2.一种大豆ADF基因在花器官改造中的应用，其特征在于按如下步骤实现：

1）大豆ADF基因的克隆

设计一对引物如下:

上游引物: 5'-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3'

下游引物: 5'-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3'

提取大豆品种：N2899叶的总RNA, 经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增；其中PCR反应体系为25μL，包含模板1.0 μLcDNA 50ng.μL^-1， 2 μL 10×Taq 缓冲液, 1.2 μLMgCL₂ 25 mmoL.L^-1, 0.5 μL dNTPs 10 mmoL.L^-1, 0.5μL Taq聚合酶5 U.μL^-1， 1.0 μL上游引物10pmoL.μL^-1，1.0 μL下游引物10pmoL.μL^-1，用ddH₂O补齐至25 μL；PCR反应程序为: 95℃预变性4 min, 反应共30个循环包括95℃变性50s, 56℃退火50s, 72℃延伸1min,最后72℃保温10 min；再将PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆的cDNA序列SEQ ID NO. 1；

2）植物表达载体的构建

设计一对过量表达的特异性引物：

上游引物：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACG

CAGCATCTGGTATGGC -3'

下游引物：5'- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGC

TTTTGAACAC -3'

将经PCR扩增并测序后的目的序列与donor vector进行BP反应，得到的entry 

clone再与destination vector pMDC83进行LR反应，获得植物表达载体；

 3）转基因植株的获得

将步骤2）获得的表达载体经液氮冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105，进一步转化烟草；对获得的转基因烟草植株进行PCR，RT-PCR验证后再对阳性植株的表型进行分析；转基因烟草植株部分开花提前，花瓣的数目或增加或减少，并且花瓣的空间分布呈多样性；此外，有的花出现了融合的现象，即共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊，这样的位置关系导致了该类型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看则呈两小半且表面较为光滑，有粘性。