[发明专利]一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种检测BRAF基因突变的方法和试剂盒。

背景技术

结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一。近年来研究发现结肠癌的发生途径除经典的“腺瘤-癌”途径外，还存在“畸形隐窝灶-增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌”途径，即锯齿状腺瘤途径。该途径由有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activedprotein kinases，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinases，ERK)信号通路调控，BRAF基因是其重要的调控因子。

BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，BRAF蛋白位于MAPK/ERK途径的入口处，将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。在结直肠癌(CRC)中，BRAF突变率约为15％左右，这些突变主要发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。

有研究发现，在结肠癌EGFR靶向药物的临床治疗中，KRAS基因突变会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物(西妥西单抗、帕尼单抗)产生耐药。但是在KRAS野生型患者中使用抗EGFR单抗治疗，部分没有KRAS基因突变的患者也会对EGFR靶向药物产生耐药性，研究证明这主要是由于KRAS下游的BRAF基因V600E突变造成的。进一步研究显示，KRAS下游基因BRAF突变状况与西妥昔单抗和帕尼单抗的耐药有关：在KRAS野生型的患者中，有5％左右的BRAF基因突变，BRAF基因突变的患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗均无反应，并且无进展生存(PFS)和总生存(OS)均较BRAF野生型的患者短。Lambrechts等在2009年ASCO会议上报道BRAF的突变率为5％，与KRAS基因突变具有排他性；BRAF野生型与客观疗效及生存获益明显相关。CAIRO-2研究中，BRAF野生型患者的PFS与OS均优于BRAF基因突变型患者。提示BRAF野生型患者可从抗EGFR单抗治疗中获益。

美国国家癌症综合网络(NCCN)在2010年版的结肠癌病理评估原则4-3中指出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行KRAS基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。同时NCCN新增了针对KRAS基因检测无突变的患者，在诊断检测中推荐加入BRAF基因状态检测的评估原则，并指出对于KRAS基因野生型但同时具有BRAF V600E突变的患者，似乎抗EGFR抗体靶向治疗无效，已知BRAF突变的患者似乎不能从抗EGFR抗体靶向的治疗中获益。因此BRAF基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。

但是，尽管BRAF基因突变的意义已得到重视和临床应用，目前全球范围内仍缺乏标准化的检测方法。

传统的直接测序方法一直是公认的“金标准”，但是这种方法的灵敏度低，要求突变率达到20％-30％时才能检出，因此需要显微切割或选择性组织抽提来富集突变细胞。且费用高、通量低、检测周期长，临床应用局限性大。

限制性片段多态性分析(RFLP)虽然具有较高的灵敏度，但所检测的突变位点必须具有限制性内切酶的酶切位点，实际设计和操作复杂。

高效变性液相(dHPLC)的灵敏度在5％-10％之间，但只能区分杂合型样本，当检测纯合型样本时，需要掺入野生型样本混合成杂合型来检测，带来额外的检测费用、延长了检测周期。

上面的几种检测方法由于自身的缺陷，在临床应用方面局限性较大，至今仍然只是作为一种检测方法，而非成品试剂盒。

高分辨率熔解(High-resolution melting，简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对于传统的突变分析而言，操作步骤大大简化，时间和成本也降低了不少。而且样品经PCR扩增后直接进行HRM分析，无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。

现有技术中，采用高分辨率熔解分析BRAF基因突变的报道有：