[发明专利]一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括用于对BRAF基因第15号外显子的密码子600进行基因分型的特异性探针，所述的特异性探针包含密码子600的核苷酸序列，所述BRAF基因第15号外显子具有SEQ ID No：1的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：特异性探针为SEQ ID No.2。

3.根据权利要求1所述的一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：特异性探针3’端经封闭处理、无法延伸。

4.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、特异性引物对、SYTO 9荧光染料、水和野生型对照，其中特异性引物选自：

5.根据权利要求1所述的检测人结直肠癌BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于：每20μl PCR反应体系终浓度组成为：2μl 10×PCR缓冲液、0.6-1.0μl氯化镁溶液、1.6μl dNTP、0.1-0.3μl Taq DNA聚合酶、100-200nM正向引物和20-40nM反向引物、100-200nM特异性探针，2-5μl SYTO 9荧光染料，其余为水。

6.一种检测人结直肠癌BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照常规方法采集待分析的基因组DNA；

2)对上述基因组DNA进行BRAF基因15号外显子的PCR扩增，再通过Cold-PCR富集扩增产物；反应完成后，将扩增产物再进行变性熔解；

3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的BRAF基因进行突变位点检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2中PCR扩增的过程为95℃15分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行20个循环。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤2中Cold-PCR富集过程为82℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，进行15个循环；72℃2分钟；反应完成后，将扩增产物再进行变复性，90℃30秒，50℃1分钟。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤2中加入的DNA提取液的体积根据提取液中DNA浓度而调整，使加入的DNA量达到10ng。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3中，P CR扩增产物样本在LightCycler 480仪中进行熔解曲线分析，仪器以0.2℃/s的速度从72℃升温到95℃，获得样品的熔解曲线。