[发明专利]用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测结肠直肠癌诊断用的结肠直肠癌特异性甲基化标志物基因的甲基化的方法，尤其涉及检测结肠直肠癌特异性标志物基因的方法，该基因在结肠直肠癌细胞中被特异性地甲基化，从而为诊断结肠直肠癌提供信息。

背景技术

即便是在医学科学进步的当今时代，癌症患者，尤其是实体瘤患者（不同于血液癌患者）的5年生存率也低于50%，且全部癌症患者中的大约2/3都在晚期确诊，并且几乎全都在癌症诊断后的两年内去世。癌症治疗中这样的糟糕结果不仅是治疗方法的问题，还归因于早期癌症诊断、晚期癌症的确诊以及对癌症治疗后癌症患者的后续追踪的不易。

目前的临床实践中，经病史询问、身体检查和临床评估，如果疑似患有癌症，再以放射线检测和内窥镜检查，之后才通过组织活检确诊为癌症。然而，只有当癌细胞数量超过十亿，且癌直径大于1cm时，通过现有的临床实践诊断癌症才是可能的。这种情况下，癌细胞已经具备了转移能力，并且其中至少半数已经转移。同时，用于监测由癌症直接或间接产生的物质的肿瘤标志物被用于癌症筛查，但它们由于准确性有限会造成干扰，因为其中多达半数的肿瘤标志物甚至在癌症存在的情况系下也表现为正常，却经常在甚至未患癌症的情况下表现为阳性。另外，主要用于癌症治疗的抗癌剂具有只在癌体积较小时才有效的问题。

癌症难以诊断和治疗的原因在于，癌细胞的高度复杂性和可变性。癌细胞过度且持续生长，侵害周围组织，并转移至远端器官，导致死亡。尽管有免疫机制的攻击或抗癌治疗，癌细胞依然存活，持续发展，且最适于存活的细胞群选择性繁殖。癌细胞是具有高度生存力的活体，它的发生是由大量基因的突变所致。为使一个细胞转变成癌细胞，并发展成临床可检测的恶性癌瘤块，必须发生大量基因突变。因此，为了从根本上诊断和治疗癌症，需要基因水平的治疗途径。

近来，人们积极地尝试遗传分析技术来诊断癌症。最简单的典型方法是用PCR检测血液中ABL：BCR融合基因（白血病的遗传特征）的存在。该方法准确率超过95%，且在使用这一简单易行的遗传分析来诊断和治疗慢性粒细胞白血病后，该方法还被用于结果评估和后续研究。然而，该方法的缺陷在于，其只能用于某些血液癌。

此外，还尝试过另一种方法，其中使用RT-PCR和印迹技术来检测癌细胞表达基因的存在，从而诊断血细胞中癌细胞的存在。然而，该方法的缺点在于，它只能用于一些癌症，包括前列腺癌和黑色素瘤，且假阳性率高。另外，该方法中难以标准化检测和读取，其效用也有限（Kopreski,M.S.et al.,Clin.Cancer Res.,5:1961,1999;Miyashiro,I.et al.,Clin.Chem.,47:505,2001）。

近来，人们积极地尝试了使用血清或血浆中DNA的基因检测方法。这是一种检测癌症相关基因的方法，所述癌症相关基因分离自癌细胞并释放入血液中，并在血清中以游离DNA形式存在。据发现，实际癌症患者血浆中DNA的浓度是正常人的5-10，这些增加的DNA大多数由癌细胞释放。利用这些分离自癌细胞的DNA，分析癌症特异性基因的异常，例如突变、缺失以及原癌基因（oncogene）和肿瘤抑制基因的功能缺失，可以诊断癌症。在这方面，人们已有积极的尝试，通过检测血清中突变K-Ras原癌基因、p53肿瘤抑制基因和p16基因的启动子甲基化，以及微卫星的标记和不稳定性，用以诊断肺癌、头颈癌、乳腺癌、结肠直肠癌及肝癌(Chen,X.Q.et al.,Clin.Cancer Res.,5:2297,1999;Esteller,M.et al.,Cancer Res.,59:67,1999;Sanchez-Cespedes,M.et al.,Cancer Res.,60:892,2000;Sozzi,G.etal.,Clin.Cancer Res.,5:2689,1999)。