[发明专利]细胞的选择性裂解

说明书

发明领域

本发明涉及真核细胞，特别是动物细胞，例如血细胞的裂解。本发明还涉及具有高浓度的其他细胞的样品中的低浓度微生物例如细菌的检测。

发明背景

分子诊断旨在快速检测样品例如血液中的微量病原体(通常是细菌)。然而血液是复杂的基质，且包含用于获得性免疫系统的白细胞(white blood cell)(白细胞(leukocyte))，用于运输氧的红细胞(red blood cell)(红细胞(erythrocyte))和用于伤口愈合的血小板(凝血细胞)。这使包含高量的细胞物质的样品例如全血中的病原体的直接检测变得复杂。

经典的检测方法包括在选择性培养基和/或带有指示剂的培养基上培养细菌。通常，在可进行鉴定之前，这些测定需要至少1或2天的培养步骤。

对于基于PCR的方法，新鲜血液样品中细菌的量理论上是足够高以被检测的而无需进一步培养该样品内存在的细菌。然而，为实现微量细菌的早期检测，需要大体积的血液。特别是白细胞中的高量的DNA明显升高了基于DNA的检测方法中的背景。另外，血红蛋白中血红素的存在强烈降低了DNA聚合酶的活性。1微升的人血包含约4,000至11,000个白细胞和约150,000至400,000个血小板。血液中DNA的浓度在约30和60μg/ml之间。检测体积为10ml的全血中约10至100,000的细菌物种的存在是非常有挑战性的。

白细胞的高量DNA可产生不相关的PCR产物，或可清除为检测细菌DNA而设计的引物。这使得在可通过PCR或其他方法检测细菌DNA之前彻底纯化DNA和分离哺乳动物DNA成为必要。

除了干扰PCR反应本身，哺乳动物DNA的量增加样品的粘度。另外，来自裂解过的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成阻碍样品过滤的复合物。这对于微型装置特别成问题。进一步稀释已经大的样品体积导致不可接受的长的操作步骤。

由于以上原因，所以需要去除血液样品中的人DNA的方法。

在哺乳动物DNA存在下专门测定细菌DNA的方法是已知的。来自SIRSLab公司的Looxter^TM使用了富集样品中甲基化DNA的方法。由于细菌DNA是高度甲基化的，该方法促使富集细菌DNA。来自Molzym公司的Molysis^TM使用了离液剂和去污剂来选择性裂解哺乳动物细胞。该裂解步骤之后为用不受该离液剂/去污剂影响的DNA酶消化。例如由Roche商业化的替代性方法(Septifast^TM)依赖于为防止非特异性结合人DNA和扩增人DNA而设计的PCR引物对。

US 6,803,208描述了一种方法，其中在37℃下裂解掺杂细菌的血小板的高度稀释的悬浮液15分钟，随后在0.4μm滤器上过滤小量的裂解样品以目视检查截留在滤器上的细菌是可能的。然而该方法不允许在环境温度下处理大体积的样品。

发明概述

在所附独立和从属权利要求中列出了本发明的具体和优选的方面。可适当地将从属权利要求的特征与独立权利要求的特征和与其他从属权利要求的特征组合而不仅限于这些权利要求中明确列出的特征。

本发明的一个方面涉及用于选择性裂解包含或疑似包含微生物的样品中的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法包括以下步骤：提供包含或疑似包含微生物的带有真核细胞，特别是动物细胞的样品，向该样品中加入非离子型去污剂和缓冲液以获得具有约9.5或更高的pH的溶液，和将该溶液孵育足够长的时间段例如30秒和10分钟之间，更优选2和6分钟之间以裂解所述真核细胞，特别是动物细胞。在具体实施方式中，可在15至30℃下，更优选接近室温下进行裂解。

在具体实施方式中，样品是哺乳动物血液样品例如全血。

在其他具体实施方式中，微生物是细菌或真菌。

根据具体实施方式，其中所加入的去污剂和所加入的缓冲液的体积与样品的体积之间的比例在2/1和1/10之间。

在具体实施方式中，非离子型去污剂选自包含Nonidet、Brij、吐温、Igepal、还原型triton、辛基葡糖苷、cholaat和Triton的组。更优选的实例是Triton X-100、Nonidet P40、脱氧胆酸钠和或IgepalCA 630。