[发明专利]用于扩增靶核酸的方法

说明书

本发明涉及用于扩增在核酸样品中存在的靶核酸的改进方法。在此类方法中，将样品片段化并且将含有靶核酸的片段(“靶片段”)与提供的探针杂交，所述探针含有与靶片段互补的序列，排列为在杂交时使得靶片段采用环形构象。探针被固定在固相上，便于在探针-靶片段杂交中的靶片段的连接-介导的环化之前进行去除非靶核酸的分离步骤。接着扩增环化的靶片段，并且可通过例如核酸测序、微阵列、qPCR等等对扩增产物进行随后的分析。本发明特别涉及这样的改进，其中杂交步骤和连接步骤被分开，并在分立的步骤中、在分开的溶液中进行，允许例如，在连接之前分离并去除未杂交的片段和核酸。本发明的方法特别适合核酸的多重靶向扩增。

通常期望能选择性多重扩增许多感兴趣的基因组区，例如为了分析在生理或病理状况中的牵涉的候选区域。特别地，伴随着下一代平行测序技术的出现，为了克服基因组分析中由于聚合酶链式反应(PCR)对于高多重扩增的不适宜性导致的瓶颈，需要允许即时制备感兴趣大的基因组区样品的方法。充分开发下一代测序器的测序通量的成本有效的靶向重测序需要能特异性平行扩增大量的靶基因组序列的方法。

从WO 99/49079中可知，一种用于从核酸样品中扩增靶核酸的不依赖于PCR的方法是使样品片段化以生成含有靶核酸的片段并且通过将片段与下述的线性寡核苷酸探针杂交使片段环化，所述探针被设计以含有分别与片段的5′和3′末端序列互补的相邻序列。探针可被固定化。通过相邻杂交的末端的连接，片段随后被环化，并且接着通过滚环扩增(RCA)被扩增。但是，WO 99/49079中没有公开此类方法的多重实施方式。

WO 01/38580公开了固定化的“锚定引物”，其可使靶核酸环化用于随后例如通过RCA的扩增。

在WO 2005/111236中公开用于从核酸样品中多重扩增靶核酸的溶液相(非固定化探针)方法。在该方法中，具有在双链部分侧翼的单链末端的部分双链探针通过它们的单链末端以靶特异性方式与从核酸样品的片段化产生的靶片段的两个末端都杂交。连接步骤导致探针-靶片段杂交体环化。探针的双链区(其一个链形成环化的探针-靶片段杂交体的部分)含有引物对基元，所述引物对基元对于在多重检验中使用的许多不同的靶-特异性探针是相同的。因此，多种靶片段的PCR扩增可同时实现，同时避免由于使用多种不同的引物对而可能导致的扩增假象(artefacts)。

现已令人吃惊地发现，通过在靶片段与探针的杂交和随后的连接(环化)之间进行分离步骤，在分别使用如在WO 99/49079或WO 2005/111236中描述的单链或部分双链探针的方法的情况下，可实现出乎意料的良好结果。在分离步骤中，探针-靶片段杂交体被从样品中特别是从未杂交的片段或其他核酸中分离。此种效果是不可预见的。通常不会预见到通过在连接步骤之前(即在杂交后并且在连接前)分离探针靶片段杂交体与通过在连接步骤后分离相比将使得所述方法获得的结果差异显著。的确，如果预见在此类方法的步骤顺序中分离步骤的位置将具有重要作用，考虑到靶片段与通过连接而被稳定的探针的结合，在连接步骤之后分离将是有利的。特别地，如果探针被固定，这将导致被稳定的靶片段的固定，因而提高其与未非特异性固定的核酸的分离。事实上，已令人吃惊地发现，相反是正确的；当杂交步骤和连接步骤被分离步骤分开(即在连接之前分离)时获得的结果显著好于无分离步骤或分离步骤在连接步骤之后时获得的结果。

不希望受理论束缚，我们相信，若未由连接之前的分离步骤去除，非靶“背景(background)”核酸片段分子间或分子内连接为容易扩增的线性多连体分子或环形分子。经历连接后分离步骤留下来的任何此类分子引起扩增步骤期间高水平的背景扩增。可以认为，通过在连接前将靶(探针杂交的)片段与非靶片段分离，分离步骤后在固相上剩余的任何非靶片段由于它们的低浓度和/或由于它们与固相附接导致的空间位阻而具有低的连接概率。此类片段较低的连接成容易扩增种类的水平导致背景扩增的水平显著降低。

因而，本发明提供用于扩增核酸样品中的至少一种靶核酸的方法，其包括：

(a)使核酸样品片段化，以产生至少一种靶片段，所述靶片段包含所述靶核酸并包含两个探针互补部分，其中所述两个探针互补部分的至少一个位于靶片段的末端；

(b)使所述片段化的核酸样品与至少一种探针接触，所述探针具有固定化部件并任选地通过所述部件被固定在固相上，并且所述探针包含与靶片段的探针互补部分在序列上互补的两个靶片段互补部分，其中探针的所述部分可以是紧邻的，或被中间非靶片段互补部分分开；