[发明专利]中度嗜热芽孢杆菌对蔗糖的发酵

说明书

本发明涉及中度嗜热芽孢杆菌(Bacillus)菌株的遗传修饰，以将利用蔗糖的能力提供给最初不具有该能力的芽孢杆菌菌株。

中度嗜热芽孢杆菌菌种，优选为兼性厌氧和同型乳酸的那些菌种，是用于乳酸的工业生产的理想生物体。

在本发明的内容中，中度嗜热芽孢杆菌菌种能够在37至65℃下生长，并且可以在高于50℃的温度下进行工业发酵。这种高发酵温度在以工业规模发酵时具有几个优点：感染的风险较低，并且因此产物纯度较高、反应较快等等。此外，这些细菌的营养需求比那些乳酸细菌(如，乳杆菌属(Lactobacillus)菌种)的需求要低，这还使得工业过程相对廉价。

中度嗜热芽孢杆菌菌种包括需氧菌种和兼性厌氧菌种。优选使用兼性厌氧菌种，因为这些菌种使得可以在厌氧条件下，或至少在低氧分压下进行发酵，这对于工业规模是理想的。这样的条件不需要高成本的通风，并且能够使用低成本培养基，同时最小化污染风险，乃至允许非无菌生产程序。

还优选使用同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌菌种。同型乳酸性质使得可以从烃源(包括己糖和戊糖；参见WO04/063382)生产乳酸，而没有形成超过15wt％的副产物，如甲酸和乙酸。同型乳酸表型的遗传修饰可以用于将同型乳酸菌株转化成同型发酵菌株，用于可从糖酵解，如从磷酸烯醇丙酮酸和/或丙酮酸获得的其他工业产物。这些化合物的实例是丙酮酸、乙酰乳酸、双乙酰、醋偶姻、2，3-丁二醇、1，2-丙二醇、醋酸、甲酸盐、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸盐、延胡索酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。

优选地，这些生产菌株是产孢缺陷型的。

中度嗜热且兼性厌氧芽孢杆菌菌种的实例是凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、热嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus thermoamylovorans)和热阴沟芽孢杆菌(Bacillus thermocloacae)，至少头两种菌种也是同型乳酸的。优选的菌种是凝结芽孢杆菌。

在工业发酵中，理想的是在发酵培养基中使用廉价的原材料。例如，蔗糖或含蔗糖物质常常被用作用于工业发酵的低成本碳源。然而，发现了不是所有用于工业发酵的中度嗜热芽孢杆菌菌株都具有利用蔗糖作为碳源的能力。这是个缺陷，尤其是如果这样的菌株已经经过改造来提高它们以工业规模的发酵能力或生产潜能。例如，凝结芽孢杆菌菌株DSM 1看来是非常差的蔗糖发酵菌。使用蔗糖作为唯一碳源时，观察到仅有很少的生长和酸形成，这可能是由于系统对利用其他糖的非特异性活性引起的。

在文献中，提及凝结芽孢杆菌的蔗糖利用能力是可变的(De Clerck，E.，M.Rodriguez-Diaz，G.Forsyth，L.Lebbe，N.Logan，2004：Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains.(凝结芽孢杆菌菌株的多相表征))，Syst.Appl.Microbiol.27：50-60)。然而，没有任何可获得的关于蔗糖分解代谢中所涉及的基因的信息，并且在凝结芽孢杆菌36D1基因组序列中不存在任何为蔗糖分解代谢注释的基因(http://genome.jgi-psf.org/draft microbes/bacco/bacco.home.html)。

因此，本发明的一个目的是对最初不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株进行遗传修饰，以提供具有利用蔗糖作为碳源的能力的菌株。本发明的另一个目的是利用一种方法来生产目标化合物，包括依靠含蔗糖的碳源来培养中度嗜热芽孢杆菌菌株。

不能利用蔗糖作为碳源的中度嗜热芽孢杆菌菌株可能缺少一个或多个蔗糖利用中所涉及的基因。

现在本发明公开了蔗糖分解代谢中所涉及的并且可获自中度嗜热芽孢杆菌菌种的新的基因和多肽，优选获自中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种，最优选获自是同型乳酸的中度嗜热且兼性厌氧的芽孢杆菌菌种。

新的多肽令人惊讶地展示出与来自其他芽孢杆菌菌种的相应多肽具有相当低的同源性，而观察到与来自乳杆菌菌种的相应多肽具有较高的同源性。新的基因和多肽可以将蔗糖利用能力引入与从其可以获得新基因和多肽的菌种相同(或密切相关)的菌种的非蔗糖利用中度嗜热芽孢杆菌菌株中。特别地，新基因可以通过自体无性繁殖(即，利用物种特异性遗传物质)来引入遗传物质。