[发明专利]对FMR1和FMR2基因5’非翻译区进行表征的PCR方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2009年3月24日提交的美国临时申请61/162,977的权利。

发明描述

发明领域

本发明属于DNA合成与分析领域，特别是涉及富含GC的模板和产物。

概述

自从首次分离到DNA合成酶并确定了体外合成DNA的条件，DNA合成反应已被广泛在生物技术、医药和研究应用中用于制备和分析目的。聚合酶链式反应，或PCR是可以快速和指数性扩增DNA序列的一类DNA合成反应。与其他循环进行的合成反应一样，PCR涉及以循环的方式反复拷贝靶序列。典型的PCR实施过程包括提供与待扩增序列末端互补的引物、合适的缓冲液、镁盐、脱氧核苷三磷酸(dNTPs)和嗜热DNA聚合酶。包含在例如基因组DNA样品中的模板或靶DNA与这些成分在水溶液中接触。混合物在不同温度进行循环，这些温度促进模板的变性、引物与模板的退火、然后聚合酶对引物的延伸，从而产生更多产物。由于每个循环的产物可以在随后的反应中作为模板，产物的量几乎指数增长直至其他反应成分(开始过量存在)被耗尽。参见例如美国专利4,683,202；M.J.McPherson & S.G.Moller，PCR：The Basics(2^nd Ed.，Taylor & Francis)(2006)。

PCR与其他形式的循环进行的核酸合成反应对于分子生物学、生物技术、以及日渐地对于医学都是标准工具。PCR和相关技术的关键优势是快速、低成本、敏感度、可用于高通量分析以及多能性。扩增只需要几小时甚至更短时间、少数的个别反应可能只耗费1美元以下的试剂、需要的模板量通常在纳克级别、自动化使得每个机器人每天可以进行几千个反应，可以设计出用于扩增几乎任何序列的引物。

PCR及相关技术被广泛用于分析和制备应用。PCR的典型制备用途是用于扩增序列使它可以克隆到异源载体中。PCR重要的分析应用包括涉及具有大小多态性的基因座的病情诊断或基因型确定。

表现出医学相关的大小多态性的基因座一个例子是，位于人X染色体上的FMR1基因的5’非翻译区(UTR)。正常个体的该区域内通常有5-44个CGG重复。相反，含有200到2000或更多个CGG重复的基因座等位基因指示着脆性X染色体综合征(FXS)。这种等位基因被称为全突变等位基因(Full Mutation alleles)。它们在遗传学上不稳定。患有FXS的个体可能有诸如共济失调、卵巢早衰、学习障碍和其他认知/行为状况(包括类自闭症症状)的症状的各种组合。

PCR多能性的一个令人遗憾的例外是难以扩增富含GC序列的长片段，包括FMR15’UTR的全突变等位基因。对FMR1 PCR进行的优化企图包括对常规PCR方法条件的改进。参见Genome Res.6(7)：633-8(1996)；Nucleic Acids Res.25(19)：3957-8(1997)；J.Mol.Diagn 8：544-550(2006)；Am.J.Med.Genet.51(4)：527-34(1994)。但是在FMR1 PCR方法发展了15年多以后，即使最近的2008年(Genet.Med.10(10)：714-9(2008))，一篇发表的关于检测新生儿中脆性X染色体的试验性筛选研究仍报道说“在确定女性中FMR1重复数目的内部验证过程中使用的...两种定量链式聚合酶反应(PCR)分析方法未能产生可靠和可重复的结果(粗体是后加的)，此外“由初级或次级分离物进行的二次PCR的失败高度提示FMR1 CGG重复的异常大小”。因此，本领域技术人员仍然把可重复地PCR扩增全突变脆性X染色体等位基因看作是有待解决的问题。

在通过PCR检测含有超过100个重复的CGG三联重复区时观察到，随着重复数目的增加，检测越来越弱(J.Mol.Diagn.7：605-12(2005))。这一困难，结合FXS综合征的各不相同的特性，导致为了检测全突变等位基因使用诸如Southern印迹的程序(同上)。Southern印迹通常比PCR更耗时，成本更高，没有PCR适合用于高通量应用。