[发明专利]在琼脂培养基上分离或计数微生物的方法

说明书

本发明的领域为复杂样品中靶微生物的分析。更特别地，本发明涉及一种用于在琼脂培养基上从待分析的液体样品或从微生物的悬浮液分离或者甚至计数微生物方法。

在琼脂培养基上从待分析的液体样品或者从微生物的悬浮液分离微生物是对于许多微生物学分析方法常常必不可少的步骤。该步骤特别用于进行鉴定、检测样品的微生物纯度或者还通过计数所得的分离菌落来进行细菌计数。

该细菌分离步骤的一个主要问题涉及待涂布的微生物量和可利用的表面积之间的比例。这是因为大部分琼脂培养基支持体的表面积使其仅可分离15-300CFU(菌落形成单位)之间的细菌量，在生长之后也仅给出如此多的菌落。

在大部分情况下，待分析的样品含有不确定量的微生物，其范围可以从0至多于10⁸细菌/毫升(ml)。因此，为了确保有效的分离，在琼脂培养基上涂布之前，必须进行一系列级联稀释(通常为10倍)，以便通过相继的阶段消耗样品的微生物负荷。然后将如此制备的给定体积的每个稀释液涂布在琼脂培养基上。然后将对应每个稀释液的培养皿在恒温室中温育。在微生物生长之后，可以选择皿上的微生物负荷低到足以区分以及任选地传代培养分离的菌落的琼脂培养基培养皿。

从进行微生物计数的角度来看，必须要使用仅包含分离的菌落的培养皿。当其包含15-300个分离的菌落时，以这种方式获得的结果被认为是可靠的。

虽然有效，此前所述的常规分离方法的实施具有非常费力和消耗大量试剂(培养皿、稀释剂管、环等)产生大量废物(高压灭菌、处理的费用)的缺点。

凭借设备发展的益处，一些手动方法已被自动化。例如，在文件EP-0 242 114中即是这种情况，其描述了用样品接种培养基的装置和方法。所述方法包括产生从接种物开始的几个涂布区段。这些区段为圆弧的形式并且通过4个不同的涂布头(d’étalement)的工具(moyen)来产生。通过随后区段的部分重叠而获得样品的稀释效果。该文件中所述的方法实际上与参考手动分离方法非常相似，所述参考手动分离方法包括从单个接种物产生几个具有区段重叠的涂布区段，以便使接种工具负荷细菌并在随后的区段涂布过程中使细菌的消耗。

文件FR-A-2694570描述了通过在流体交流中以口针(stylet)的手段在培养基上沉积细菌溶液的方法和系统，其经由管道且具有液压泵(vérin)驱动的细菌溶液分布器(distributeur)。通过在将细菌溶液倒入培养基的同时旋转专用平台上的培养基，使细菌溶液以螺旋或点的形式沉积。这样的方法不能被认为是分离方法，因为细菌溶液在整个培养基旋转过程中被倒出。确切地说，没有细菌溶液的消耗以及由此而来的细菌的消耗。

最近，新的分离方法已出现，其通过利用优化的涂布器使得可以提高细菌的消耗(WO-A-2005071055)。对于申请人以参考PREVI^TM Isola销售的自动装置中所用的接种方法尤其是这样的。该新分离方法的实施使得可以从待分析初始样品中更广范围的微生物负荷来获得分离的菌落。尽管使用该优化的涂布器提供了改善，涉及微生物负荷/琼脂表面积比例的约束仍然存在，并且使用该技术可以发现其具有非常高污染样品的限制。此外，目前该技术不可以进行初始样品的微生物负荷的精确估算，因为菌落接近难以计数。

考虑到现有技术没有出现用于分离或甚至计数微生物的方法，所述方法易于在单一琼脂培养基上从待分析的样品或从细菌悬浮液进行，并且使得可以在有限的琼脂表面积上获得分离的菌落，不论所述样品或所述悬浮液的初始细菌负荷如何。

因此本发明的第一个目的是提供用于分离微生物的比现有技术方法更有效的方法。

本发明的第二个目的是提供比现有技术方法更有效的计数方法。

本发明的第三个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其使得可以从非常广范围的微生物负荷获得分离的菌落。

本发明的第四个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其使得可以获得初始样品或初始悬浮液的微生物负荷的可靠估算。

本发明的第五个目的是提供用于分离或甚至计数微生物的方法，其可以在减少的琼脂培养基表面积上进行。

其中这些目的通过本发明来实现，其首先涉及用于在琼脂培养基上分离微生物的方法，包括以下步骤：

●在所述琼脂培养基上沉积预定体积的任选含有所述微生物的待分析的样品或所述微生物的悬浮液，

●将接种工具应用于所述琼脂培养基，与所述体积的样品或悬浮液接触，