[发明专利]普洱茶微生物菌群中的优势细菌及其谱图

说明书

技术领域

本发明涉及鉴定普洱茶渥堆发酵过程中优势细菌菌群结构的鉴定方法及其专用引物和DGGE指纹谱图。

背景技术

普洱熟茶是以云南特有大叶茶[Camellia sinensis(Linn)var.assamica(Masters)Kitamura]的晒青毛茶为原料，在微生物的作用下，经快速的人工渥堆后发酵而成的后发酵茶类。微生物在普洱茶的渥堆发酵生产过程中起着重要的作用，离开了微生物，普洱茶的品质和风味将得不到保证，本发明研究了渥堆发酵普洱茶中的优势微生物菌群，并提供了鉴定方法，如果将这些优势菌群用于普洱茶的渥堆发酵生产过程，将有利于普洱茶的生产和提高质量。

目前，渥堆发酵普洱茶中微生物的研究，主要是应用传统微生物分离、纯化、鉴定等方法。传统的研究方法是首先从特定样品中取样，采用模拟自然环境的各种培养基和条件进行分离培养，通过纯培养获得菌株后，再对其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察)进行观察收集，同时进行一系列繁杂的形态特征和生理生化实验，才能对其特性进行描述，这种方法又被称作经典方法。

应用传统方法可以分离培养的微生物不一定是优势菌群，只是它们适合并能够在人工培养条件下被分离纯化，不能动态反映大曲微生物菌群的生长状态。在实验技术上，普洱茶微生物研究仍停留在细胞水平，主要研究细菌、霉菌、酵母和放线菌单一的菌落形态和纯种的生长特性。在实验结果上，不能反映分离物间的系统发育关系，不能获得微生物多样性的真正概貌。因此传统的依靠培养的方法制约了人们对微生物生态的客观认识，对于人们正确认识微生物群落结构与功能，正确认识微生物资源，正确开发并利用这些资源造成了严重的障碍。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，任意位点的单碱基突变的DNA片段和原始的DNA片段能被分开，经过序列测定和比较就可以找出突变的位点。变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离，因为在含有呈线形增加梯度变性剂(尿素和甲酞胺)的混合物的聚丙烯酰胺凝胶电泳中部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率降低。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)自1993年以来被用于环境微生物领域来研究环境样品中微生物的群落结构，它是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA(真核生物)等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开，这就为后续的进一步研究提出了新的问题。由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所以PCR-DGGE可以对环境样品中的微生物群落进行研究。

然而，渥堆发酵普洱茶与城市污水厂污泥和农田土壤的化学、物理性质高度异质，微生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行渥堆发酵普洱茶微生物群落构成研究的相关报道。

发明内容

为提高普洱茶质量和提高普洱茶产量，本发明研究了普洱茶渥堆发酵过程中优势细菌菌群的鉴定方法，本发明通过提取全部细菌菌群中的DNA并从中分离出优势细菌菌群的DNA，测定优势细菌菌群的DNA结构，和标准细菌菌群比较，得到详细的优势细菌菌群的种类和名称。

本发明提供一种普洱茶渥堆发酵过程中优势细菌菌群的鉴定方法。

本发明的鉴定方法，包括以下步骤：

1)取渥堆发酵过程中不同翻堆次数和位置的普洱茶作为待测样品；

2)提取待测样品的总DNA，并对其进行纯化；

3)以待测样品的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收及纯化；

4)对纯化的目的片段进行变性梯度凝胶电泳，染色后得到DGGE指纹图谱；

5)从凝胶中回收优势条带，并以此为模板，在上游引物338F：5‘-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；下游引物R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，引导下进行PCR扩增，扩增结束后，对目的片段进行回收，纯化及测序；

6)步骤5的测序结果和标准菌群的序列进行比对，确定渥堆发酵普洱茶的优势细菌菌群。