[发明专利]一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法

权利要求书

1.一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：

(1)针对HBV基因序列可能存在的突变位点在序列中的位置设计两对巢式PCR扩增引物，用所述第一对PCR扩增引物对待测样本中的DNA进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮PCR的扩增产物为模板，用所述第二对PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增；

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

(3)对在步骤(2)中得到的测序结果进行数据分析，确定突变位点。

2.权利要求1的检测方法，其中

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)。

3.权利要求1或2的方法，其中所述测序采用第一代测序方法，优选地采用Sanger法，特别优选地采用3730测序仪(ABI)进行测序。

4.权利要求1或2的方法，其中所述测序采用第二代测序方法，例如采用SOLEXA测序法或454测序法。

5.前述权利要求任一项的方法，其中所述待测样本选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

6.前述权利要求任一项的方法，其中所述核苷酸突变位点包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L。

7.前述权利要求任一项的方法，其中在步骤(1)和步骤(2)之间纯化所述PCR扩增产物，优选采用凝胶电泳后切胶纯化法纯化所述PCR扩增产物。

8.一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测试剂盒，包括两对巢式PCR扩增引物，其中

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：

上游：5’-TGGACTTCTCTCAATTTTCT-3’(SEQ ID NO：3)；

下游：5’-TGACAGACTTTCCAATCAAT-3’(SEQ ID NO：4)；

该检测试剂盒优选地还包括PCR试剂、测序试剂、阴性及阳性对照和说明书等；其中所述核苷酸突变位点优选地包括rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T/V、rtN236T、rtT184G/S/A/I/L/F、rtA194T、rtS202I/G、rtM204V/I和rtM250V/I/L；所述待测样本优选地选自血浆、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒的媒介生物。

9.权利要求8的试剂盒用于检测HBV基因的核苷酸突变位点的用途。

10.SEQ ID NO：1-4的核苷酸序列及其作为引物用于HBV基因的核苷酸突变位点的检测的用途。