[发明专利]一种辣椒DN突变体及其载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种辣椒DN-CaROP1突变体及其超表达载体的构建及在基因工程中的应用，更具体地涉及到了该辣椒突变体在茄科植物烟草抗衰老基因工程中的应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

植物生长、发育和对环境应答是其特定的遗传系统和所处的环境条件相互作用下通过复杂的生理生化过程实现的，总是受到较为严密的调控以使其产生足够的光合产物并合理的分配和使用这些光合产物，最终使植物在特定的环境下获得最大的生存和传衍的机会。由钙信使系统、植物内源激素、磷酸激酶系统、转录因子等组成的信号传导是植物生长、发育和适应环境调控的重要环节，植物细胞可感知外界环境各种信息并进行信号的整合、传递，最终将信号传递进入细胞核调节相关基因的表达，使植物产生有利于其生存和传衍的生理生化反应。

辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的茄科植物，也是具有重要经济价值的蔬菜。辣椒的生产长期受到病害及其它各种逆境的困扰，对农药和化肥等的过分依赖导致的环境、健康方面的隐患促使人们从遗传改良上或从栽培管理上采取更加可持续的、切实可行的对策，需要从分子水平上对辣椒等茄科植物的抗逆分子机制作更深入的剖析和了解。从应答逆境的信号传递入手是剖析辣椒抗逆分子机制的重要途径，因此，辣椒抗逆信号传递分子机制研究已经引起了人们的高度重视，并在膜定位相关受体蛋白（An et al.,2008）、钙信使相关蛋白(Choi et al., 2009)、激酶(Chung et al.,2004)、转录因子(Lee at al.)等多个信号传递联结开展了大量的研究，但人们的对辣椒抗逆及其与生长发育之间的关系及其分子机制的认识还相当有限。

鉴于ROP位于调控植物生长发育和抗逆信号传递途径的上游，在植物生长发育及对环境逆境胁迫应答中发挥重要调节作用，从辣椒的ROP分离和功能鉴定入手可能是揭示辣椒等茄科植物抗逆分子机制的重要契入点。

自在植物体内发现ROP以来，已有越来越多研究发现ROP在植物体内多种信号途径中起关键作用，每一成员可能作用于不同的途径，几种不同的途径可能融合于同一个ROP（Jones et al.,2005；Yalovsky et al.,2008），同时在植物中也存在ROP的功能冗余，导致缺少某一种ROP时很少有明显的表型变化，所以在研究ROP时很少只单独采用基因功能敲除法进行研究。研究ROP功能的重要手段之一就是构建DN（dominant negative）和CA（constitutive active）突变体，前者是使ROP锁定在GDP结合态形成失活型突变体，后者是将ROP锁定于GTP束缚态形成激活型突变体（Kost et al.,1999；Li et al.,1999；Lemichez et al.,2001；Li et al.,2001），这种突变体蛋白的表达打乱了内源ROP蛋白的激活态和失活态之间的平衡，有助于ROP蛋白的功能分析（Yang，2002）。目前尚未有利用DN突变体研究植物抗衰老的文献报道。

发明内容

本发现提供了一种辣椒DN突变体及其超表达载体构建和在基因工程中的应用，将大力促进烟草抗衰老基因工程的发展与应用。

本发明的辣椒DN突变体为DN-CaROP1突变体，该突变体基因至少含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

构建方法如下：

将辣椒DN-CaROP1突变体与CaMV35S启动子核心序列融合，构建成DN-CaROP1的超表达载体。所述辣椒DN-CaROP1是从UV-B辐射辣椒叶片的cDNA文库中分离获得的CaROP1基因的DN突变体。

构建的超表达载体在茄科植物烟草抗衰老基因工程中的应用。将所述超表达载体转化EHA105 农杆菌，采用叶盘遗传转化法侵染烟草得到转基因烟草，提高转基因烟草的抗衰老能力。

本发明的显著优点：

本发明的辣椒DN-CaROP1突变体在烟草中的超表达与野生型烟草相比，显著提高了转基因烟草的抗衰老能力，该突变体在植物抗衰老基因工程中具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为CaROP1中的保守功能域；

图2为CaROP1与其它ROP家族成员的系统发育树；

图3为CaROP1定点突变图；

图4为入门载体pDONR207；

图5为超表达载体pK7WG2；

图6为DN-CaROP1转基因植株与野生型植株的生长状况；

图7为DN-CaROP1转基因植株与野生型植株的叶片的叶绿素含量测定。

具体实施方式

1 载体构建过程