[发明专利]茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及茯砖茶中金花菌的分离纯化及其有性型与无性型亚显微特征的鉴定方法。所述金花，即冠突散囊菌。

背景技术

茯砖茶是古老茶类——黑茶中的高档品种。与其它茶类的不同之处在于茯砖茶的制作过程中多了一步“发花”工艺，从而使其在饮用的过程中具有特殊的“菌花香”，而“发花”的实质是促进冠突散囊菌(Eurotium cristatum)滋生，产生金黄色的闭囊壳(俗称“金花”)的过程并且消费者根据“金花”的多少来评价茯砖茶品质好坏。

从20世纪50年代就有学者对茯砖茶发花中优势菌种名的鉴定做过研究。1952年赵学慧曾研究指出茯砖茶的“金花菌”为子囊菌纲(Ascomycetes)闭囊壳菌类(Plectomycetes))，其种名可能是谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri)或匍匐曲霉(A.repers)。但由于缺乏电镜观察有性和无性孢子形态特征的证据，故未定论。1986年温琼英对该菌的子囊孢子进行了电镜观察并拍摄了照片，与英联邦真菌研究所的冠突曲霉模式菌株172280作了比较，认为此菌与模式菌株在培养特征和显微特征上是一致的，因此将该菌初步定为冠突曲霉(A.cristatum)。1990年齐祖同对该菌又作了进一步的研究，认为使用冠突曲霉这一名称与国际植物命名法规相抵触，正式将该菌鉴定为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)，无性型名称为针刺曲霉(A.spiculosus)，异名为冠突曲霉。但同年，刘作易对不同来源茯砖茶上“金花菌”的生长发育过程、形态特征、菌落特征、子囊孢子和分生孢子的亚显微结构等进行了研究，鉴定为灰绿曲霉组谢瓦氏曲霉变种(A.chevalieri var.intermidius)。1991年，王志刚等人对18份茯砖茶样品进行分离鉴定，共分离出冠突散囊菌、间型散囊菌(E.intermedius)、匍匐散囊菌(E.repens)、谢瓦散囊菌(E.chevalieri)、阿姆斯特丹散囊菌(E.amstelodami)、赤散囊菌(E.rubrum)和一种未定名的散囊菌(E.sp.)共7种散囊菌。由此可见，前人在缺乏电镜观察其有性和无性孢子亚显微结构特征的前提下，仅凭肉眼观察菌落特征和光镜观察显微结构而对“金花菌”进行种名鉴定有一定的局限性。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：解决上述现有技术存在的问题，而提供一种茯砖茶中金花菌菌种鉴定方法，对茯砖茶金花菌进行分离、纯化及其有性型与无性型进行鉴定，为茯砖茶金花菌对茯砖茶食用安全性以及对茶叶品质影响和茯砖茶保健功能等后续研究奠定基础。

本发明采用的技术方案是：将茯砖茶的金花菌接种于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)上进行分离、纯化，再通过20％察式培养基与70％察氏培养基分别诱导产生有性型与无性型，观察其菌落结构，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其显微结构，对金花菌进行鉴定。

上述技术方案中，所述的茯砖茶的金花菌接种于PDA培养基上进行分离、纯化，具体为：将长有金花的茶叶或茶梗接种于PDA培养基上，27℃下恒温箱培养3天，挑取菌种一小块接种于PDA平板中央，反复三次后，菌落外形一致即已纯化，将纯化了的单个菌种接种于PDA斜面培养基上，于27℃下培养，长成菌落后于4℃冰箱保存。

上述技术方案中，所述的通过20％察氏培养基诱导产生有性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于20％察式培养基上(CZ20)上，27℃下恒温箱培养12天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花有性型为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。

上述技术方案中，所述的通过70％察氏培养基诱导产生无性型，观察其菌落结构，具体为：从纯化的PDA培养基上挑取一小块菌落接种于70％察式培养基(CZ70)上，27℃恒温箱培养3天，观察其形态特征，并结合光学显微镜与电子显微镜观察其亚显微结构，鉴定金花菌无性型为小冠曲霉(Aspergilus cristatellus)

由此可见，金花菌是产生有性型即子囊孢子阶段和无性型即分生孢子阶段的全型真菌，以《The GENUS Aspergillus》(Raper and Fennen 1965)为主要鉴定参考，按照国际植物命名法规它的正确名称是以有性型为模式的最早合法名称，故金花菌鉴定结果为冠突散囊菌。

上述技术方案中，所述的PDA指Potato Dextrose Agar的简称，中文含义为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基。