[发明专利]大生物分子流通纯化方法

说明书

相关申请

本申请要求2009年12月16日提交的美国临时专利申请No.61/284,368的优先权，其以全文援引加入本文。

发明领域

本发明至少部分涉及新的及改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗(conjugate vaccine)与一或多种污染物分离的流通(flow-through)纯化方法。

发明背景

在大生物分子如例如包囊的病毒、感染的宿主细胞或卵中的病毒样颗粒或者结合疫苗产生后，希望将所述生物分子与感染的宿主细胞或者卵的其它成分例如DNA、RNA及宿主细胞蛋白分离以获得所述生物分子的基本纯的群体。此外，所产生的生物分子需要与通常用于促进该生物分子产生的一些添加剂分离，因为所述添加剂常能与该生物分子共纯化。

常规地，许多技术如超速离心、层析和膜过滤已经用于纯化浓缩大生物分子如包囊的病毒和病毒样颗粒(见例如PCT公开WO2008/073490和WO2004/112707)。用于纯化这种生物分子的各种类型的层析技术包括例如大小排阻层析(SEC)、阴离子交换层析(AEX)和亲和层析(见例如WO2004/112707；Transfiguracuin et al.，J Virol Methods 142：21-28(2007)和Kalbfuss et al.Biotech.Bioeng.96：932-944(2007))。

虽然前述技术在一定程度上用于纯化大分子如包囊的病毒和病毒样颗粒，但是所有这些层析技术一般以结合和洗脱模式使用。特别地，由于这种生物分子的大尺寸(例如～15-400nM)，其不能穿透大多数可商购的介质的孔，且因此其通常与该介质的外部结合并随后被洗脱。然而，污染物和杂质一般结合至颗粒的内表面，但有时部分地与所述大生物分子一起洗脱。此外，一或多种这些技术有时以非连续模式使用，然而总产量一般较差。

发明概述

本发明至少部分提供了改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒及结合疫苗与一或多种污染物分离的流通方法。本发明利用一或多种层析技术以流通模式纯化大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒、结合疫苗以及细菌细胞表面多糖，所述层析技术包括例如阴离子交换层析(AEX)、阳离子交换层析(CEX)及疏水性相互作用层析(HIC)。

本发明的方法通常使用单一连续流通方法致使大生物分子如病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗的回收改良，这种方法远远优于本领域目前常用的一般为结合和洗脱模式且非连续的常规方法。本发明的方法至少部分基于使用至少一种类型的层析颗粒(例如固体多孔珠)，其每单位体积外表面积被最小化而相对于通常用于层析方法中而其每单位体积外表面积未被最小化的相似层析颗粒，其每单位体积内表面积未降低25％以上。一般而言，本发明至少部分依赖于反向模式操作，即通过以流通模式使用一或多种AEX、CEX和HIC层析介质，其中至少一种这样的介质包含致使回收改良的特性，例如最小化的每单位体积外表面积以及未降低25％以上的每单位体积内表面积。

本发明的方法使得可以在单一步骤中回收大生物分子以及提供了与需要许多纯化前和纯化后步骤的常规层析方法相比最少的进料(feed)和产物流的上游和下游处理。此外，本发明的方法在含有大生物分子的样品中存在和不存在宿主细胞蛋白质的情况下均导致所述大生物分子回收的改良。

在本发明的一个方面，提供了用于从包含大生物分子和一或多种污染物的样品中对所述大生物分子的回收进行改良的流通方法。这种方法包括使样品与具有小于所回收的大生物分子的分子量截断值的一或多种固体多孔颗粒群接触，其中所述流通方法中使用的至少一种固体多孔颗粒群的每单位体积外表面积是最小化的并且其中每单位体积内表面积相对于不包含最小化的每单位体积外表面积的固体多孔颗粒群未降低25％以上，从而改良所述大生物分子的回收。

在一些实施方案中，将所述一或多种固体多孔颗粒群填充在层析柱中。

与不使用包含最小化的每单位体积外表面积以及每单位体积内表面积未降低25％以上的至少一种固体多孔颗粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，本发明的流通方法导致大生物分子的回收改良例如至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。

在一些实施方案中，本发明的流通方法导致大生物分子的纯度改良至少20％。