[发明专利]一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法

权利要求书

1.一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，包括：

(1)酶标板包被100～300μl菠萝蛋白酶溶液，4℃轻微震荡，孵育12-24h，之后冲洗包被液，加满封阻液，0～4℃静置1～2h，完成后去除封阻液，用TBST缓冲液迅速洗酶标板2～10次；噬菌体7肽库以5～10倍稀释度加入上述酶标板的酶标孔中，摇动1～2h，TBST缓冲液迅速洗酶标板2～10次，用50～100μg/ml游离菠萝蛋白酶分子TBS洗脱液竞争性洗脱吸附在固相酶标板上的噬菌体，室温摇动1～2h，洗脱下来的噬菌体作滴度测试；

(2)挑取ER2738菌株培养于LB-Tet培养液中，25～37℃180～200rpm振荡培养12-24h，之后用不加抗生素Tet的LB培养液1∶50～1∶100稀释并再次培养待用，步骤(1)噬菌体洗脱液定量加入至上述大肠杆菌菌液中，25～37℃，60～100rpm感染1～2h，0～4℃，离心10～20min，去上清，菌体重悬至100～200ml LB培养液中培养8～14h，取培养后的菌液0～4℃，离心10～20min，取上清，加入体积比为1∶3～1∶6的聚乙二醇和氯化钠，震荡混匀后冰置1～2h，在0～4℃，8000～15000rpm离心10～20min去上清，沉淀物重悬于1～2ml TBS溶液，再加体积比为1∶3～1∶6的聚乙二醇和氯化钠溶液进行再沉淀，冰置1～2h后，0～4℃，8000～12000rpm离心10～20min，弃上清，再快速离心移去残余上清液，沉淀重悬于100～200μl TBS，0.01～0.02％NaN₃中，得扩增后的噬菌液；

(3)将上述扩增后的噬菌液分别用TBS缓冲液稀释10～10³倍，噬菌液加入到大肠杆菌菌液，快速震荡混匀，室温温育2～5min，然后将感染的菌液注入40～50℃的顶层琼脂试管中，快速震荡混匀并立即倾注于25～37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上，均匀铺开，25～37℃倒置培养12-24h，之后计数平板；

(4)挑取上述LB-IPTG/Xgal平板上蓝色噬菌斑10～20个分别装入上述1～2ml ER2738菌液中，25～37℃180～220rpm震荡培养4～5h，离心后取上清液即得单克隆扩增液；

(5)100～300μl pH 8.6菠萝蛋白酶0～4℃包被12-24h，吸出包被液，加满封阻液，25～37℃静置1～2h，完成后吸出封闭液，用TBST快速洗板2～10次，每孔加入100～300μlTBST，每排第二孔加入10～20μl的单克隆扩增液，并稀释至12孔，25～37℃缓慢震荡1～2h，甩出单克隆扩增液，TBST洗涤6～10次后，每孔加入100～300ul抗fd噬菌体生物素复合物，轻轻混匀20～30sec，封板后25～37℃温育1～2h，TBST再次洗涤6～10次，每孔加入100～300ul抗生物素辣根过氧化物酶复合物，轻轻混匀20～30sec，封板，25～37℃同样温育1～2h，TBST再次洗板6～10次，每孔加入100～300ul邻苯二胺显色液，轻轻混匀5～10sec，25～37℃暗处显色0.2～1h，显色后每孔加入100～300μl 1～2MH₂SO₄终止液，轻轻混匀20～30sec；20～30min内测OD值；

(6)挑取步骤(5)中的ELISA阳性单克隆噬菌体以-96引物进行测序，解读7肽氨基酸排列序列。

2.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的酶标板为96孔酶标板。

3.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于：所述步骤(2)中洗脱下来的噬菌液5～10μl用作滴度测试，待用的宿主大肠杆菌ER2738的菌种浓度为OD A₆₀₀＝0.2～0.5。

4.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的噬菌体扩增计算的有效值为每个平板含有噬菌斑1～100个。

5.根据权利要求1所述的一种亲和筛选菠萝蛋白酶的亲和配基的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的滴度测试中，噬菌液体积为5～10μl，大肠杆菌ER2738的体积为100～200μl。