[发明专利]一种可提高转基因作物细菌抗性的基因GhMKK5及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5的克隆、重组及在提高转基因烟草细菌抗性的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

细菌性病害是由细菌病菌侵染所导致的病害，防治难度比较大。我国主要的细菌性作物病害有60-70种，病害分布范围极广，能够侵染多种植株。感病植株往往发病部位广(根、茎、叶均可发病)、死亡率高、传播性强，造成农作物大量减产甚至绝产。因此，细菌性病害的防治工作已经成为一个世界性的难题并越来越受到人们的重视。早期细菌性病害的防治措施主要集中在施用化学农药、改善栽培管理技术及选育抗病品种等方面。然而，长期施用大量化学农药不但造成了严重的环境污染，而且影响了农作物的品质，危害了人体健康；改善的栽培管理技术受地域条件等因素的限制不能被广泛采用；传统的育种方式由于育种周期长、工作量大、成本高等弊端也越来越受到限制。近年来，分子生物学和基因工程技术的迅速发展为作物疾病的防治提供了新的思路。相对于传统的品种选育方法，转基因技术的应用具有快速、高效的优点，能够大大缩短品种选育的周期，克服杂交不亲和的障碍。但是，目前转基因技术仍然存在一定的弊端，尤其是抗病转基因植物的研究还不完善。植物自身存在许多抗病或与抗病相关的基因，这些基因是植物应对病原菌入侵的关键因子，然而将单一的抗病目的基因转入植物中往往不能达到理想的防治效果。梁元发等将抗菌肽基因(天蚕-Hyalophora cecropia Cecropin)转入马铃薯脱毒微型薯块中，结果发现转基因株系间抗性差异过大，某些株系仍然高度感病(梁元发等，2004)。因此，植物自身各方面防御性的提高才是增强植物抗病能力最根本的措施。而植物一般是通过某些基因的表达来激活信号通路或信号传导网络来提高植物的防御力。目前，有关信号通路相关的基因已成为植物转基因研究的热点。

促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径是真核生物中保守的信号传导模式，在胞内细胞信号的传导过程中发挥着重要的作用。它能够响应环境压力、机械损伤、植物激素、病原物侵染等多种刺激，促使植物产生相应的免疫性，增强植物自身的防御系统(Mizoguchi et al.，1998；Burnett et al.，2000；Ahlfors et al.，2004；Asai et al.，2002)。MAPKK位于MAPK级联系统的中游，它接受MAPKKK的信号后再通过双磷酸化作用激活其特异的MAPK，从而调节特异基因的表达，使植物能够响应多种胁迫刺激。然而，目前国内外尚没有关于棉花MAPKK应用于改良作物农艺性状的报道。

棉花作为世界上最重要的经济作物之一，生产成本低，应用价值高，但是它的生长和产量严重受到病原物侵染的抑制。关于棉花功能基因，特别是抗性基因的研究不仅可以为植物基因工程提供优良的基因源，而且对于棉花遗传改良、提高其抗病性也具有重要的现实意义。

三、发明内容

本发明的目的旨在提供一种棉花抗细菌病害相关基因GhMKK5，同时提供该基因在抗细菌，尤其是青枯病害及细菌性斑点病害的转基因烟草中的应用，并应用于生产其它具有明显抵抗细菌病害能力的转基因植物。

本发明中提供的核苷酸序列来自棉花。

本发明利用同源克隆和RACE技术获得了棉花抗细菌病害相关基因GhMKK5，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库(GenBank)中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计简并引物，序列如下：

MP 1：AARGTNATHGGNAARGG

MP2：CCCAARCTCCAVATRTCNCT

其中，R＝A，G；H＝A，T，C；V＝G，A，C；N＝A，T，C，G

利用上述简并引物进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与克隆载体(pMD18-T)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后筛选重组子，进行序列分析。根据获得的序列设计引物，引物序列如下：

5P1：GACTTTGTAAACGGTGCCTCC

5P2：CAAGGCGTTGGAGTTGGAG

3P1：CTACGATGGTTACGCTGGGG

3P2：CCCTTTCGCAGTTGGTAGAC