[发明专利]一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法

说明书

技术领域本发明涉及一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的制备新方法。主要包括柱分离浓缩富集以及快速的高效液相制备方法精制。三种对照品的结构式如下：

背景技术

蛹虫草是名贵中药冬虫夏草的替代品，二者具有相似的成分及功效，均具有补肾益肺、止血化痰等功效。所含的核苷类成分为其主要活性成分及质控指标成分，因此，制备高纯度核苷类化合物对于更深入研究其药理药效及相关虫草药材的质量控制具有重要意义。

目前，单一虫草素对照品的制备方法报道较多，主要有等电点沉淀法、离子交换树脂层析、硅胶正相色谱等，步骤较多；有少量反相高效制备的文献(上海农业学报，2007，23(1)：59-61；中国发明专利CN01124109.8)，但一般为分析规模及半制备规模，制备通量很小。

N6-(2-羟乙基)腺苷对照品的制备方法报道较少，柴一秋等采用萃取、大孔树脂层析、Art.柱、Sephadex LH-20柱制备该化合物(中国发明专利CN2004100094511.0)；吕子明等采用硅藻土层析、树脂层析、硅胶柱层析、重结晶等步骤纯化该化合物。二者工艺均较为繁琐(中国中药杂志，2008，33(24)：2914-2917)。

同时制备腺苷和虫草素的文献也较少，董培智等采用酸碱处理、反复萃取及硅胶柱层析成功制备了腺苷和虫草素(山西医药杂志，2007，36(10)：949-950)。而同时获取腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三个对照品的制备工艺未见报道。

发明内容

本发明旨在提供一种同时获取腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三个对照品的高效制备工艺，其制备规模达到10克级。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种同时制备腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品的方法，蛹虫草提取物，经树脂柱分离及制备高效液相色谱两步高效纯化，同时获得纯度大于98％的腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷三种化学对照品，其具体步骤如下：

1)树脂柱分离除杂：

蛹虫草菌丝体，乙醇溶液提取，提取液进行树脂柱分离，先以水、10％乙醇溶液洗脱除去杂质，然后以体积分数在15％-25％之间的任一乙醇溶液洗脱，收集相应乙醇洗脱物，浓缩干燥得红色浸膏；

2)制备高效液相色谱精制：

红色浸膏用低浓度甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相高效液相制备色谱分离，以甲醇-水溶液为洗脱体系，紫外检测器260nm监测，分别收集制备图谱中三个主要的色谱峰，相应流份干燥即可得到纯度大于98％的三个对照品，其外观为白色粉末。

所述步骤1)的具体过程为：蛹虫草菌丝体用体积分数为0％-40％的乙醇溶液提取，采用HPD-100、Diaion或D101树脂分离；

所述步骤2)的具体过程为：红色浸膏用体积分数为10％-20％的甲醇溶液溶解，配置样品浓度为50～150mg/ml；制备色谱柱的填充填料为C18，制备柱长10-30cm、直径2-10cm；采用的流动相为体积分数为10％-20％的甲醇水溶液；进样体积为1-40ml，流速控制在140-180ml/min；收集保留时间分别为8.2-8.7min(腺苷)、10.3-10.9min(虫草素)和14.8-15.2min(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，干燥获取三种对照品。

为确证本发明所制备的对照品的结构，腺苷和虫草素分别和法定对照品比较了保留时间、UV、MS、MS/MS等；N6-(2-羟乙基)腺苷测试了UV、MS、MS/MS、HR-MS、1H NMR、13C NMR等。

以本发明从蛹虫草提取物中分离腺苷、虫草素、N6-(2-羟乙基)腺苷化学对照品具有如下优点和进步：

1.本发明工艺简单，蛹虫草提取物通过树脂分离和制备型高效液相制备两步高效纯化，即可同时获取高纯度的三种对照品。有利于资源利用最大化。

2.本发明工艺非常适宜规模化工艺生产。发展的高效液相制备方法为快速制备方法，一次进样分离时间在16分钟，适合大批量化学对照品的制备；高效制备之前有预处理步骤，避免了批量制备中制备柱柱效下降过快的缺点；所用流动相不含有添加剂，可方便实现制备溶剂的回收利用，降低批量制备的成本。

附图说明

图1为制备高效液相的制备色谱图(260nm)；

图2为腺苷的HPLC分析图谱(260nm)；

图3为虫草素的HPLC分析图谱(260nm)；

图4为N6-(2-羟乙基)腺苷的HPLC分析图谱(260nm)；