[发明专利]表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌

说明书

一、技术领域

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体讲涉及高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素表达性质粒pLEM415-PHA1的构建、重组嗜酸乳杆菌4356菌株的获得以及高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的表达与鉴定。

二、背景技术

几个世纪以来，乳酸杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业，以乳酸杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20％。数千年，乳酸杆菌被人类大量食用，没有引起任何的健康问题；同时乳酸杆菌可以作为抗原递送载体诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的空间。

1乳酸杆菌对黏膜免疫的影响

乳酸杆菌是人体和动物肠道中一种正常的益生菌，具有多种生理功能，如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能，在科学界越来越显示出强大的生命力。作为一种重要的益生菌，多年来乳酸杆菌被大量用于食品的制造业，如干酪、酸乳酪和干腊肠。数千年来人们大量的消费这些食品，从未引起任何的健康问题。作为口服疫苗，乳酸杆菌还具有很好的安全性。因此，乳酸杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原递送载体。

进入胃肠道中的乳酸杆菌具备抗胆汁酸和在胃肠道中持续存在的能力，与一般微生物抗原一样。乳酸杆菌在诱导黏膜免疫应答时或是经过小肠上皮之间的微皱褶细胞(microfold cell，M细胞)，或者通过上皮下的树突状细胞(dendritic cell，DC)进入固有层，激活Th2淋巴细胞，产生大量的白介素(IL)-5。后者是有效的IgA刺激因子，可激活B细胞，分泌IgA，IgA与肠黏膜上皮产生的分泌片段结合，形成黏膜表面抗体sIgA(分泌型IgA)，阻止致病菌的吸附和入侵。许多乳酸杆菌由于抗酸、抗胆汁盐特性，能够顺利通过胃和回肠，大量存在于小肠和大肠的上游处。乳酸杆菌进入胃肠道后可持续诱导局部细胞免疫和体液免疫，并具有减少变态反应、增强肠道屏障功能和治疗自身免疫病等功能。

乳酸杆菌能显著增加肠道中非特异性和特异性抗体水平。对0-6个月健康新生儿的研究发现，肠道内的乳酸杆菌和双歧杆菌定植的时间越早，外周血中IgA细胞出现得就越早；随着肠内乳酸杆菌和双歧杆菌数目的增加，外周血中的IgA细胞的数量也增加；轮状病毒导致的腹泻婴儿中，喂食乳酸杆菌株后可使病程减短，病情减轻；减毒的Salmonellatyphi感染小鼠后，如果口服含有L.acidophilus发酵乳，小鼠体内针对S.typhi的血清总IgA水平均升高。乳酸杆菌还可明显促进小肠中细胞免疫反应，如乳酸杆菌能增强肠上皮淋巴细胞细胞毒活性，诱导产生多种淋巴因子；激发固有层CD4⁺细胞产生干扰素；增强单核-吞噬细胞的吞噬作用，从而杀灭肠道病毒和肠道内的其他细菌。小鼠口服含有大量乳酸杆菌的Kefir奶后，可以协助特异性抗原提高小肠特异性黏膜免疫反应。乳酸杆菌中含有大量未甲基化的CpG DNA，脂磷壁酸(1ipoteichoic acids，LTA)和肽聚糖。通常些物质可与Toll样受体(Toll 1ike receptors，TLRs)结合，刺激先天免疫系统产生应激反应。所以口服乳酸杆菌对增强小肠特异和非特异性免疫应答均具有重要作用。

2口服黏膜免疫研究进展

口服黏膜免疫方法简便、安全，不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性体液免疫应答，多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用，使全球小儿麻痹发病得到有效控制，为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中，口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解，疫苗很容易被破坏，影响免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗递送系统成为研究传染病防御领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向，所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中，让其表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答，又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答，使机体可以获得全面的保护力。