[发明专利]一种猪细菌的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检测方法，涉及同时对猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断的多重PCR方法。

背景技术

2001年6月起，在我国中东部的安徽、湖南、浙江等养猪业密集地区开始出现以高热、厌食、呼吸困难等为特征的“猪无名高热症”。“猪无名高热症”病原复杂，主要为多种病毒、细菌和寄生虫的混合感染与继发感染，其中包括猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、刚地弓形虫、猪附红细胞体、沙门氏菌等。本研究室对浙江省部分猪场的35例猪高热病死猪进行细菌分离与生化试验鉴定，发现主要致病菌有猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌等。

目前，实验室常用的细菌检测方法有细菌分离、间接ELISA、间接血凝、PCR、免疫荧光等，其中细菌分离和PCR方法最常用。但是，细菌分离至少需要2-3天才能得出鉴定结果，费时费力，不利于采取措施及时进行治疗，而且敏感性不高，结果不准确，容易产生假阴性结果。血清学和免疫学方法因为抗体变化没有规律也容易出现假阴性结果。多重PCR方法不仅具有普通PCR特异性强、敏感性高、快捷简便的优点，而且可以在一个反应体系中同时扩增两份或者多份DNA样本的不同目的基因片段，特别适合用于混合感染的大量临床样本的快速诊断。因此建立这3种致病菌的PCR快速诊断方法，可以为临床上这3种病的防治提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪细菌的多重PCR检测方法，主要是一种同时对猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌单个或多个混合感染的临床样品进行鉴别诊断的多重PCR方法，通过以下技术方案实现：

(1)被检标本DNA提取：取病变组织匀浆后37℃培养，再经蛋白酶K 65℃温浴消化，取消化后的培养物离心并收集沉淀，用ddH₂O重悬后再离心一次，弃上清，沉淀用等体积的2×TZ和ddH₂O重悬，-20℃静置，再经沸水浴后立即置冰浴中冷却，4℃下离心，取上清使用或者-20℃冻存备用；

(2)设置PCR检测试剂盒：由PCR试剂管、阳性对照、阴性对照、Taq DNA聚合酶、GoldView DNA染料、溴酚蓝上样缓冲液(常规浓度)组成；

(3)PCR扩增：在PCR检测试剂管中加入处理后的DNA标本及Taq DNA聚合酶，同时设阴性、阳性对照，微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心，置PCR仪进行扩增。PCR反应循环条件：95℃预变性4min，94℃变性1min，60.5℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸8min，保存于4℃；

(4)扩增产物分析：将PCR产物进行琼脂糖电泳，被检标本孔出现的电泳带与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌的阳性或阴性。

步骤(1)中2×TZ配制方法为：Triton-100：4ml，NaN₃(5mg/ml)：500mg，Tris(1M)：12.114g，加蒸馏水定容至100ml，加热溶解。

步骤(2)中的PCR试剂管内含10×PCR缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，6条引物，其中，6条引物分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：

其中阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，其构建方法是：将扩增产物分别克隆至pMD18-T Simple Vector，再转化入TOP10感受态细胞，经PCR鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒分别含有相应的目的基因片段；其中阴性对照为双重蒸馏水。

本发明的另一个目的是提供所述检测方法在猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌单个或多个混合感染的样品检测中的应用。

本发明的优点是提供了一种猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌3种细菌的多重PCR检测的标准方法，可快速、准确地检测出被检标本中的猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌，也可用于猪链球菌2型、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌病的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，常规的方法需经溶菌酶、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)等试剂处理，时间长费用高。本方法建立在分子生物学的基础上，可排除镜检时细菌和杂质颗粒的干扰，从而大大提高诊断准确率，降低假阳性率。