[发明专利]一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法

说明书

技术领域

本发明属T+1断裂蛋白质内含子的构建领域，特别是涉及一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法。

背景技术

蛋白质含子(intein)是前体蛋白质(precursorprotein)中的一段插入序列。蛋白质内含子两侧的氨基酸序列被称为蛋白质外显子(extein)。在前体蛋白质的翻译后成熟过程中蛋白质内含子从前体蛋白质中自我切除，两侧的蛋白质外显子以天然肽键连接，这一成熟过程被称为蛋白质内含子介导的蛋白质剪接(intein-mediated protein splicing)。常见蛋白质内含子按照其结构特征分为三类：标准蛋白质内含子(canonical intein)，微小蛋白质内含子(mini-intein)和断裂蛋白质内含子(split intein)。其中标准蛋白质内含子(canonical intein)由N端剪接区域、中部归巢核酸内切酶区域和C端剪接区域组成。N端剪接区域和C端剪接区域形成蛋白质剪接结构域，参与蛋白质剪接过程；中部归巢核酸内切酶区域独自形成归巢核酸内切酶结构域，参与蛋白质内含子的归巢过程。某些intein在进化过程中丢失或运用人工手段移去核酸内切酶结构域，由长度不等的linker连接两端的剪接结构域，成为微小蛋白质内含子(mini-intein)。典型的蛋白质内含子元件含有A，B，F和G四个保守的蛋白质剪接模块归巢核酸内切酶的序列位于模块B和F之间。而绝大部分天然或人工型断裂蛋白质内含子在模块B和F之间断裂，编码序列位于两个阅读框架中，产生C端蛋白质内含子片段(I_C)和N端蛋白质内含子片段(I_N)。翻译后的两部分序列能够相互识别，进行反式剪接(trans-splicing)。split intein的这一特性已被成功应用于蛋白质研究中，例如蛋白质的自身环化、作为标签辅助蛋白质纯化、蛋白质特异位点的修饰、基因治疗以及蛋白与蛋白之间的相互作用和细胞定位等研究。

蛋白质内含子的分子机制包括剪接位点的N-S(N-O)酰基转化，分支中间物的形成，天冬酰胺残基的环化和自发的S-N(O-N)的酰基重排四步反应。C端外显子(C-extein)的第一个氨基酸残基较为保守，一般为Cys/Ser/Thr，普遍认为该氨基酸在蛋白内含子自我剪接反应中意义重大，它所发动的亲核进攻使N端内含子与外显子间发生断裂，由此推进剪接反应的进程。因此按C-extein首位氨基酸种类将蛋白质内含子划分为Cys+1(C+1)、Ser+1(S+1)和Thr+1(T+1)型三类。然而应用于研究中的蛋白质内含子均为C+1和S+1型，它们仅在Cys和Ser前插入后行使功能，而在Thr前面插入时丧失原有剪接活性。这无疑限制了intein在蛋白质研究领域的应用范围，获得一类对C-extein首位氨基酸通用性高的split intein对其得到广泛应用具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法，方法简单，转换成C+1型或S+1型split intein后它仍具有剪接能力，具有较高通用性。

本发明的一种T+1断裂蛋白质内含子的构建方法，包括：

(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；

引物序列：上游引物为5’-AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC-3’，下游引物为5’-AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA-3’；

或引物序列：上游引物为5’-AAGTTAATCAATTAACATAAATTTCTGTATCGTG-3’，下游引物为5’-AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGCAGAA-3’；

(2)将上述PCR产物自连转化感受态细胞后得到的质粒经限制性内切酶双酶切，回收600-700bp小片段；

(3)利用限制性内切酶双酶切pMBT-0质粒，并回收6000-7000片段，然后与上述小片段进行连接转化，得到pMSnf-S质粒。

所述步骤(1)使用的模板为pUCSnf-m：在NCBI的intein数据库中获得Ter Snf2的序列，通过基因合成方法去除124-424bp的长度为199bp的序列并替换为linker(ASGHHHHHHHGGSGSG)即为Snf-m(mini-intein)，将其装在上下游含有XhoI和AgeI两酶切位点的PUC 57载体中。

所述步骤(2)或(3)中的限制性内切酶为XhoI和AgeI，XhoI和AgeI的摩尔比为2∶1。