[发明专利]胸腺肽注射液的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种胸腺肽注射液的制备方法。

背景技术

胸腺肽注射液，曾用名：胸腺素注射液、胸腺因子注射液、胸腺因子D注射液，系由健康猪或小牛胸腺组织中提取的分子量小于10000道尔顿的多肽水溶液。本品具有调节和增强人体免疫功能的作用，能促使T-淋巴细胞成熟。用于治疗各种原发性或继发性T细胞缺陷病、某些自身免疫性疾病、各种细胞免疫功能低下的疾病及肿瘤的辅助治疗。

目前，已公开了一些有关胸腺肽的制备工艺，是经冻融破细胞、离心分离、超滤、浓缩等过程。通常包括以下方法：(1)用绞肉机或匀浆器将新鲜的的胸腺匀浆，冻融，以破碎细胞；(2)用水在酸性或中性环境中提取破碎细胞；(3)将提取液加热到80℃左右维持10分钟，离心除蛋白沉淀；(4)离心液经10000分子量左右的超滤膜超滤得胸腺肽：(5)根据胸腺肽含量加注射用水配制各种浓度注射液制剂。

上述的工艺方法仅经过热变性去除杂蛋白，不能充分有效的去除各类杂蛋白，杂蛋白未有效去除易引起过敏反应；其次热变性时间短，不能有效去除各类动物源性病毒，使制剂存在病毒污染风险；再者注射液中氨基酸、小肽类物质易发生聚合为大分子物质而析出致使制剂不稳定，也易引起过敏反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胸腺肽注射液的制备方法，以克服上述技术的缺陷。

本发明的胸腺肽注射液的制备方法的技术方案为：它是将小牛或猪的胸腺组织去除脂肪，洗净后，与0.9克/毫升的氯化钠水溶液按1∶1的重量比例混合后利用胶体磨研磨得到绞磨液，将绞磨液用体积浓度为20％的冰醋酸调节pH值3.5-4.5，在-15～-22℃温度下冷冻冷；将冷冻后的绞磨液化冻升温至33-37℃匀浆得匀浆液，然后加温到80℃，保温30分钟，再离心分离得第一上清液；将第一上清液按1∶1的体积比加入无水乙醇，0-5℃静置1 2小时以上，再离心分离得第二上清液；浓缩第二上清液至原匀浆液体积的1/4～1/6得浓缩液；浓缩液调节pH值7.5-8.5，然后加温至80℃，保温30分钟，再降温至10℃～0℃以下后，离心分离得第三上清液；第三上清液先后用50KD、10KD超滤膜逐级超滤澄清后再利用5KD至8KD的超滤膜超滤得胸腺肽溶液；在胸腺肽溶液中加入注射用水调节至每毫升溶液中含胸腺肽2.5mg或5mg或10mg；加入稳定剂，灭菌后即得胸腺肽注射液。

本发明先后通过50KD、10KD，5KD超滤膜多级超滤，既能保证杂蛋白的彻底去除，又能有效地去除高分子量物质；采用乙醇和酸碱沉淀去除杂蛋白，以及多级超滤，制得产品高分子物质少于0.5％，远远低于国家标准规定的少于5.0％，能更有效地保证产品质量，制剂配料过程中加入吐温-80作稳定剂，能有效得避免制剂在储存过程中氨基酸、小肽类物质等聚合为大分子物质析出，影响制剂的澄明度，保证产品长时间储存过程的稳定，同时降低过敏反应发生率。

具体实施方式

取新鲜的小牛(或猪)胸腺组织，剥离其附着的脂肪，用饮用水和纯化水先后分别清洗三次。

将小牛(或猪)胸腺组织与0.9克/毫升的氯化钠水溶液即生理盐水(温度不高于30℃)按1∶1的重量比例混合后加入胶体磨反复绞磨两次，收集绞磨液。

将绞磨液用用20％的冰醋酸调节pH值3.5-4.5，置于冷库冷冻7天以上。

取出冷冻7天以上的绞磨液化冻后置反应罐在33-37℃匀浆4-5小时，然后加温到80℃，保温30分钟，再离心(3000转/分钟，时间为30分钟)，弃沉渣取上清。

在不断搅拌下将上清液按1∶1的体积比加入无水乙醇，0-5℃静置12小时以上，离心(3000转/分钟，时间为30分钟)，弃沉渣取上清。

减压真空浓缩(温度：35-45℃真空度-0.03～-0.08MPa)至原匀浆液体积的1/5。浓缩的同时回收乙醇。

将上清液用10％氢氧化钠溶液调节pH值7.5-8.5，然后将罐内温度加温至80℃，保温30分钟，用冰水降温至10℃以下后，离心(3000转/分钟，时间为30分钟)，弃沉渣取上清。

上清液用50KD、10KD超滤膜逐级超滤澄清后得澄清液。

澄清液再用5KD-8KD超滤膜超滤得胸腺肽溶液。

制剂：将胸腺肽按质量标准方法测定多肽含量，加注射用水调节至每毫升含胸腺肽2.5mg(或5mg、10mg)，同时加入稳定剂吐温-80至每毫升含量为1-2‰，然后灌装、灭菌后即得胸腺肽注射液。

产品检测：对上述制备的产品的检测结果如下表1

检测结果表1：

病毒灭活效果检测：

按本发明的制备工艺，在匀浆液中加入伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)为指示病毒，经过80℃×30分钟的热处理后，以IBRS-2细胞作为培养用细胞，采用96孔细胞病变法检测病毒的滴度，以细胞病变(CPE)作为判别病毒存在的指标，对未出现细胞病变的样品用细胞进行盲传三代。通过病毒对照培养结果显示，采用上述热处理方法，可以使伪狂犬病毒滴度下降PRV7.4个LogTCID50/0.1ml，样本经盲传一代、二代、三代，均未见特异致细胞病变作用(CPE)。