[发明专利]具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有“转运肽”和人白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗自身免疫性反应特别是银屑病药物中的应用。

背景技术

白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)是一种多功能的细胞因子，能够抑制T细胞介导的免疫炎症反应，参与体液免疫调节。研究表明，IL-10在组织特异性自身免疫性损伤的启动和发展中起着关键性作用，并已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。其中对银屑病的治疗效果表现最为明显，欧美国家均已完成II期临床观察。

然而细胞因子这样具有生物活性的药物，半衰期太短，例如IL-10在体内的半衰期仅仅2-3h，蛋白很快被清除，无法持续发挥治疗作用，因而需要大剂量地频繁使用才能达到有效的治疗浓度，然而如此频繁用药很不方便且很痛苦，以致某些患者无法忍受该药物治疗。因此，迫切需要疗效显著，半衰期长且毒副作用小的IL-10。

同时在II期临床观察中也发现，IL-10使用剂量小则治疗效果差；而提高剂量则产生明显副作用。其原因主要由于注射给药是目前蛋白质类药物的唯一给药途径，而由于IL-10属强天然免疫抑制剂，系统性注射给药时，可导致全身免疫抑制而出现副作用。

TD-1是最新发现的一个含有11个氨基酸的透皮多肽，可帮助生物大分子(如胰岛素、生长激素和荧光素)透过皮肤，进入血液循环，是目前发现的唯一透皮多肽，被认为具有改变蛋白质药物给药途径的创新性突破。

因此，TD1成为了IL-10改变给药途径治疗银屑病的新切入点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。

本发明提供的融合蛋白，命名为TD1-IL10-IgG/Fc-γ1，人工合成，是在人白细胞介素10-蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白，且在氨基末端连接转运肽形成的融合蛋白：

1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；

2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；

所述人白细胞介素-10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；

所述转运肽(TD1)的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。

所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：

1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有透皮能力和人白细胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。

上述序列表中序列2由403个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-11位为TD-1的氨基酸残基序列，自氨基端第12-171位为人IL-10的氨基酸残基序列，自氨基端第172-403位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列。所述几个氨基酸残基的取代、缺失或添加为不超过10个氨基酸残基的取代、缺失或添加。

编码上述具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白的基因(TD1-IL10-IgG/Fc-γ1)也属于本发明的保护范围，是下述1)-4)中任一所述基因：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)序列表中序列1自5’末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。

所述严格条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

上述序列表中的序列1由1464个碱基组成，其编码序列为序列1自5’末端第1-1464位碱基，序列1自5’末端第1-255位碱基为具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段的编码序列，序列1自5’末端第256-288位碱基为转运肽TD1的编码序列，序列1自5’末端第289-768位碱基为人IL-10的编码序列，序列1自5’末端第769-1464位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列。

含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为将所述融合蛋白的编码基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I的识别位点间，得到重组表达载体pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1。