[发明专利]一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA及其制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种牛乳铁蛋白衍生来源的抗菌蛋白片段的真核表达及其产品制备方法。 

(二)背景技术

乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)是一种天然非血红素铁结合糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中，是哺乳动物非特异性免疫和获得性免疫反应重要的介导分子。乳铁蛋白是一个多效性的分子，除全长蛋白的铁离子结合能力外，乳铁蛋白及其降解产物如N-lobe、C-lobe、N-端抗菌肽——乳铁蛋白肽和乳铁蛋白两亲肽等衍生片段在广谱抗菌、抗炎症反应、抑制肿瘤生长、调节免疫动态平衡、转录调节、蛋白和核糖核酸酶作用等过程中起直接辅助作用，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品、化妆品和饲料添加剂。 

根据蛋白药物分子设计原理和方法，本发明以抗金黄色葡萄球菌为目标，以牛乳铁蛋白作为出发抗菌蛋白模板，创新性设计筛选和高效表达具有特异性抗金黄色葡萄球菌活性的抗菌多肽片段，具有重要的人与动物临床和预防医学意义。金黄色葡萄球菌是人和动物的重要病原菌之一，常引起鼻腔、口腔粘膜以及皮肤和上皮组织的感染，在兽医临床主要引起牛、羊的乳房炎，犬、猫的鼻炎、外耳炎，猪的败血症，鸡的水肿症等。金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌病对养殖业造成巨大的经济损失，对公共卫生尤其是相关从业人员的生命安全构成严重威胁。 

此外，乳铁蛋白完整分子的工业化和商业化应用也已取得了很大进展，已成为目前国内外研究的热点。美国食品药品管理局已于2001年批准乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动和功能性食品中，其抗金黄色葡萄球菌的特异性和活性都不是很高，难以满足临床和预防医学的实际需求。而小分子量抗菌肽的制备和纯化存在分离成本很高，价格昂贵，一时难以推广普及满足生产需求。应用基因工程技术在体外高效表达重组乳铁蛋白衍生抗菌片段，提高表达量和结构稳定性，有望为解决抗菌肽替代抗生素这一问题提供了有效思路。 

(三)发明内容

本发明提供的牛乳铁蛋白抗菌片段BLfA片段的真核表达及其产品制备方法的目的在于开展牛乳铁蛋白衍生抗菌分子BLfA的设计筛选、重组毕赤酵母构建和转抗菌蛋白酵母的高密度发酵研究，以突破乳铁蛋白外源表达、翻译后修饰及重组蛋白纯化的技术瓶颈，获得安全、环保、高产、高效的基因工程重组乳铁蛋白及其衍生抗菌蛋白，推进新型抗菌蛋白的工业化 应用进程。同时将为新型抗菌蛋白的分子设计、构效关系研究和乳源抗菌蛋白产业化提供理论支持。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。 

以牛乳铁蛋白分子序列为出发模板，借助计算机辅助设计手段，通过分子设计选定抗金黄色葡萄球菌导向的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA基因序列，全长1032个碱基，编码344个氨基酸残基，利用毕赤巴斯德酵母进行真核表达、包括可能发生的糖基化修饰在内，推算表达产生的重组蛋白分子量约为43KD。 

牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA序列及其推导的氨基酸序列为： 

1      ATGGCCCCGAGGAAAAACGTTCGATGGTGTACCATCTCCCAACCTGAGTGGTTCAAATGC 

1       M  A  P  R  K  N  V  R  W  C  T  I  S  Q  P  E  W  F  K  C 

61     CGCCGATGGCAGTGGAGGATGAAGAAGCTGGGTGCTCCCTCTATCACCTGTGTGAGGAGG 

21      R  R  W  Q  W  R  M  K  K  L  G  A  P  S  I  T  C  V  R  R 

121    GCCTTTGCCTTGGAATGTATCCGGGCCATCGCGGAGAAAAAGGCGGATGCTGTGACCCTG 

41      A  F  A  L  E  C  I  R  A  I  A  E  K  K  A  D  A  V  T  L 

181    GATGGTGGCATGGTGTTTGAGGCGGGCCGGGACCCCTACAAACTGCGGCCAGTAGCAGCA 

61      D  G  G  M  V  F  E  A  G  R  D  P  Y  K  L  R  P  V  A  A