[发明专利]大豆锈菌分子探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆锈菌分子探针及其制备方法，以及大豆锈菌分子探针的应用，属真菌分子生物学领域。

背景技术

由豆属层锈菌[担子菌纲(Basidomycetes)锈菌目(Urediales)栅锈科(Malampsoraceae)层锈属(Phakopsora)大豆锈菌种(Phakopsora pachyrhizi Sydow)]引起的大豆锈病曾经是热带及亚热带地区大豆生产的主要病害，进入21世纪以来，大豆锈病相继在非洲、美洲大面积流行，每年造成数十万吨的产量损失，在我国，大豆锈病是继孢囊线虫、大豆花叶病毒病之后的第三大病害。对大豆锈病的控制主要是通过化学防治，化学防治的前提是能够准确地预报病情的发展。目前，对大豆锈病的测报主要是通过观察植株的发病症状以及病原菌的生理生化鉴定等常规病理学研究方法做出判断，大豆锈菌在侵染大豆后约1周后才出现侵染病斑，2周后孢子堆破裂才表现出典型的锈菌侵染特征。已有研究表明：大豆锈病主要通过孢子的扩散进行传播，每个孢子经过7-10天的繁殖可产生数以千记的孢子。因此在发病早期对病原做出准确地鉴定，有利于减少病原数量，降低农药使用量，有效控制病情的发展。

分子生物学的研究结果表明：生物的多样性源于它们遗传物质----核酸序列的不同，每个物种均有自身特异的遗传基因即核酸排列顺序。根据每个物种特异的核酸序列设计引物，通过链式聚合反应(PCR)(Gibbs 1990；MμLlis et al.1986)将特异核酸序列在短时间内进行数百万倍的扩增，扩增产物可直观地通过琼脂糖电泳显示出来。基于PCR的分子探针检测方法最大优点在于快速、灵敏，已广泛用于医疗、食品、农业中微生物的快速检测。2002年，美国科学家根据真菌的转录体间隔区ITS区域的序列开发出大豆锈菌分子探针引物，能有效地区分大豆锈菌和细菌性叶斑病，但在早期检测方面，早期开发的探针需接种量为10⁵孢子/mL在接种后第6天才能检测到，而通常在这样的接种强度下，被侵染叶片已出现明显的侵染病斑。

参考文献：

1)Gibbs，R.A.1990，DNA amplification by the polymerase chain reaction.Analytical Chemistry 62，1202-1214。

2)Reid D.Frederick，Christine L.Snyder，Gary L.Peterson，and Morris R.Bonde Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection and Discrimination of the Soybean Rust Pathogens Phakopsora pachyrhizi and P.meibomiae，Mycology.Vol.92，No.2，2002 217。

3)Kurt H.Lamour，Ledare Finley，Karen L.Snover-Clift，James P.Stack，Joy Pierzynski，Ray Hammerschmidt，Janette L.Jacobs，Janet M.Byrne，Philip F.Harmon Anne M.Vitoreli，Gail C.Wisler，Carrie L.Harmon，Laurene Levy and Kurt A.Zeller，Christine L.Stone，Douglas G.Luster，Reid D.Frederick，2006，Early Detection of Asian Soybean Rust Using PCR，Plant Management Network。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆锈菌分子探针及其制备方法，以及大豆锈菌分子探针的应用，该探针可快速、准确的鉴定大豆锈菌。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：大豆锈菌分子探针，其特征在于：该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，上游引物、下游引物序列如下：

上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’

下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；

该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp，核酸序列如下：