[发明专利]大豆锈菌分子探针及其应用

权利要求书

1.大豆锈菌分子探针，其特征在于：

该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，上游引物、下游引物序列如下：

上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’

下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；

该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp，核酸序列如下：

caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt     60

ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt    120

gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct    180

atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca    240

gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga    300

ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa    360

ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct    420

actaaattca gtgattcaaa caagaga                                        447。

2.如权利要求1所述大豆锈菌分子探针的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1).根据已公布的大豆锈菌基因组序列信息，在大豆锈菌基因组JGIAFNA-61H15：Phakopsora pachyrhizi克隆选取447个碱基构成的基因组片段，通过在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的片段，由此推断其为大豆锈菌特异片段，其序列信息如下：

caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt     60

ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt    120

gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct    180

atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca    240

gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga    300

ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa    360

ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct    420

actaaattca gtgattcaaa caagaga                                        447；

2).根据上述序列信息设计PCR扩增引物，上游引物、下游引物序列如下：

上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’

下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；

对上游引物和下游引物进行PCR扩增后，得到大豆锈菌分子探针。

3.如权利要求1所述大豆锈菌分子探针的应用，其特征在于大豆锈菌分子探针应用于大豆锈菌分子检测，具体步骤如下：

1)大豆锈菌基因组DNA提取：大豆锈病的病原菌为担子菌纲(basidomycetes)锈菌目(Urediales)栅锈科(Malampsoraceae)层锈属(Phakopsora)大豆锈菌种(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，其基因组DNA提取方法如下：从田间采集大豆锈病叶片，用毛笔将孢子刷下，将20至100μL孢子收集入直径6CM的研钵中，DNA提取系统采用天根植物DNA提取试剂盒DP321-02，得到大豆锈菌基因组DNA提取液；

2)以大豆锈菌基因组为模板，用PCR方法对锈菌特异进行扩增，反应体系25μL，反应体系中各组分为：大豆锈菌基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl₂ 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；

3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，历时约3小时，得到PCR产物；

4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，有大豆锈菌存在的样品中，可见在350-500bp处有一特征带，没有大豆锈菌存在的样品中，则无特征带出现。