[发明专利]一种检测海水氮限制的微藻分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海水氮限制的检测方法，采用实时荧光定量PCR的方法对中肋骨条藻硝酸盐转运蛋白基因进行定量检测，属于分子检测技术领域。

背景技术

近几十年来，随着人类活动的加剧，我国近海海域中营养盐尤其是N、P的含量急剧增高，海水富营养化现象逐年加重。营养盐浓度和结构分别对浮游植物的生物量及种类组成有重要影响。对浮游植物的营养状态进行准确的评价，将有助于预测赤潮的发生动态。

在众多营养盐中，常被认为是限制性的营养元素有氮、磷及金属微量元素如铁等，其中氮是生物细胞中不可或缺的重要元素之一。在以往评价浮游植物氮限制的研究中，常见的方法包括：营养盐浓度比例、营养盐添加实验及¹⁵N标记跟踪氮摄取率等(Dugdale and Wilkerson 1986；Kilham andHecky 1988；Collos et al.1993)。这些传统的研究手段虽然有助于了解浮游植物与氮缺乏之间的相互关系，但是仍然存在一些不足之处。自然海水中浮游植物种类组成复杂，不同藻种对营养盐的需求存在很大差异，所以使用群落全体生长率或生产力来评估浮游植物收营养盐限制的做法并不恰当。且在传统的评估方法中，会先将大型浮游动物滤去以去除捕食者效应，再将浮游植物置于容器中进行培养，这种做法往往会带来一定的“培养瓶效应”(Dugdale and Wilkerson 1986；Fogg and Calvariomartinez 1989；Colloset al.1993)。随着分子生物学技术的发展，基因水平上的研究在海洋生态学中的应用越来越广泛。利用分子手段，对现场采集的样品直接分析，避开了培养过程带来的“培养瓶效应”，可对浮游植物的氮限制状态进行更准确的评价。

浮游植物在受到营养盐限制时所呈现的细胞生理反应大致可分为以下三类(Straus，1994；La Roche et al.1999)：削减(retrenchment)或向下调节生理代谢速率、补偿作用(compensation)、获取作用(acquisition)。Nicolausvon Wiren(1997)指出高等植物在缺氮时会诱导增加对硝酸盐及铵的摄取能力，也就是说细胞会发展出对氮营养盐更有效的摄取系统(第三类生理反应)。而硝酸盐及铵的摄取则必须经由细胞膜上的运输蛋白进行转运才能进入细胞内，因此通过测定硝酸盐及铵盐转运蛋白基因的表达量即可对细胞氮缺乏进行有效评估。至今已在多种浮游植物中发现硝酸盐转运蛋白基因(Hildebrand&Dahlin，2000；Michael Koltermann，2003；Qinghua He，2004；Bongkeun Song，2007)，都属于NRT2家族，可以转译出高亲和力硝酸盐转运蛋白，在缺氮或低硝酸盐浓度下负责硝酸盐的转运。

中肋骨条藻是广温广盐的典型代表，分布极广，是我国沿岸水域常见种，多在夏末秋初形成优势种，并引发赤潮。因此，通过研究中肋骨条藻硝酸盐转运蛋白基因的表达水平，能够对水体中氮营养盐的限制状况进行准确评估。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测海水中氮限制的微藻分子生物学方法，用于精确评估水体中浮游植物的N限制状况，预测浮游植物的生长乃至赤潮的发生动态。

一种检测海水水体中氮限制的微藻分子生物学方法，包括以下步骤：

a.采集生长有中肋骨条藻的待检测海水，提取RNA并反转录，得到cDNA；

b.以所得cDNA为模板，硝酸盐转运蛋白基因(NRT)为目的基因，18SrRNA为内参基因，进行real-time PCR，测定NRT基因的表达量；

c.根据NRT基因的表达量判断水体中氮营养盐的限制情况；

硝酸盐转运蛋白基因的表达量随着硝酸盐浓度的降低而升高，二者呈负相关关系，因此可以根据中肋骨条藻硝酸盐转运蛋白基因的表达量对水体中氮限制的状况作出准确定性评价。

所述步骤b中，实时荧光定量PCR反应体系为：采用SYBR Green I染色法进行实时荧光定量PCR，其PCR混合液包括10μl SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10μM)各0.4～0.6μl，Rox Reference Dye 0.4μl，cDNA10～100ng，以去离子水校正至20μl的最终体积；