[发明专利]一种检测海水氮限制的微藻分子生物学方法

权利要求书

1.一种检测海水水体中氮限制的微藻分子生物学方法，其特征在于：

包括以下步骤：

a.采集生长有中肋骨条藻的待检测海水，提取RNA并反转录，得到cDNA；

b.以所得cDNA为模板，硝酸盐转运蛋白基因为目的基因，18SrRNA为内参基因，进行real-time PCR，测定NRT基因的表达量；

C.根据NRT基因的表达量判断水体中氮营养盐的限制情况；

硝酸盐转运蛋白基因的表达量随着硝酸盐浓度的降低而升高，二者呈负相关关系，因此可以根据中肋骨条藻硝酸盐转运蛋白基因的表达量对水体中氮限制的状况作出准确定性评价。

2.根据权利要求1所述的微藻分子生物学方法，其特征在于：

所述步骤b中，实时荧光定量PCR反应体系为：采用SYBR Green I染色法进行实时荧光定量PCR，其PCR混合液包括10μl SYBR Premix ExTaq，正反向引物(10μM)各0.4～0.6μl，Rox Reference Dye 0.4μl，cDNA10～100ng，以去离子水校正至20μl的最终体积；

硝酸盐转运蛋白基因的real-time引物序列为：SCNRTfp5’-GGAGGATTCGTCTCTGACAAGG-3’，SCNRTrp5’-TATGGAACAATACCGTACGATGATC-3’；18rRNA引物序列为：SC18SrRNAfp5’-AGGTCTGTGATGCCCTTAGATGT-3’，SC18SrRNArp5’-GTTTGATGAACTGCGATTACTAGGA-3’。

3.根据权利要求1所述的微藻分子生物学方法，其特征在于：所述步骤b中实时荧光定量PCR的反应条件为：95℃5min；接着进行40个循环，每个循环包括95℃5s、60℃31s；反应完成后进行溶解曲线分析：95℃15s，60℃1min，然后缓慢升温至95℃，连续记录荧光信号的变化。

4.根据权利要求1所述的微藻分子生物学方法，其特征在于：

所述步骤c中NRT基因表达量的计算采用2^-ΔΔCt法，表达量越高表明该水体N限制作用越明显；

硝酸盐转运蛋白基因的表达量与初始的硝酸盐浓度之间的关系为y＝-1.2147x+225.52，公式中y表示硝酸盐转运蛋白基因的表达量，x表示初始硝酸盐浓度。