[发明专利]一种快速分析烟草花冠中花青素苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对天然物质进行定性定量快速分析的方法，特别涉及一种花青素苷的快速分析方法。

背景技术

花青素苷(anthocyanins)是植物花色形成的重要物质基础，因此对花青素苷成分和含量的分析是花色研究的重要内容之一。目前，花色相关的异源基因在植物中的表达研究常常以烟草(Nicotiana tabacum)作为受体材料，对于烟草中花青素苷成分分析方法已开展了一些研究，主要有如下4种方法：(1)薄层层析技术(thin layer chromatography，TLC)、(2)高效液相色谱-光电二极管阵列检测技术(high-performance liquid chromatography with a photodiodearray detector，HPLC-PAD/DAD)、(3)高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析技术(HPLC-electrospray ionization-mass spectrometry，HPLC-ESI-MS)和(4)超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)。

早期应用较多的TLC技术依赖于同已知花青素苷元标准样品迁移率的对比来确定其种类，能对花青素苷元的种类进行初步的定性研究，但结构鉴定的准确性较差，也不能进行精确的定量分析。HPLC-PAD/DAD技术是依据与已知花青素苷元标准品进行洗脱速度的对比，从而推测色素的结构，可以进行定量研究，但并不能直接确定花青素苷的种类。最近几年开始采用的HPLC-ESI-MS技术可以直接对花青素苷进行定性和定量分析，根据二级或多级质谱的结果不仅可以推定其花青素苷元的类型，还可以推测其糖苷化、酰基化和甲氧基化等情况，至今已经在许多物种中得到了较好的应用。例如荷花、牡丹和菊花等。

花色作为植物重要的生物学性状和观赏性状，一直倍受研究者的关注。近年来，利用分子生物学手段，研究者通过对花青素苷生物合成途径进行调控，创造出许多具有新异花色的花卉新品种，如矮牵牛(Petunia hybrida)、香石竹(Dianthus caryophyllus)、月季(Rosa spp.)等。花色分子育种技术的有效开展依赖于花色相关基因功能的解析。由于烟草的遗传转化体系相对成熟，因而其已经成为研究外源基因在植物体内异源表达的重要受体物种之一，花青素苷合成相关基因在烟草中异源表达可以为花青素合成调控机理的研究提供重要参考资料。

Asaph Aharoni等人研究表明矢车菊素-3-O-芸香糖苷(cyanidin-3-O-rutinoside，Cy3R)是烟草花瓣中积累的主要花青素苷，其含量占花青素苷总量的90％以上(The strawberry FaMYB1 transcription factorsuppresses anthocyanin and flavonol accumulation in transgenic tobacco；The PlantJournal，2001，28(3)，319-332)。矢车菊素-3-O-芸香糖苷的分子结构如下：

许多研究者使用的烟草花冠中花青素苷的分析方法需要将花冠中提取的花青素苷水解转化成花青素苷元(anthocyanidins)后再进行分析，如TLC和HPLC-PAD/DAD方法。这类方法最大的局限在于只能鉴定到花青素苷元的类型，不能对花青素苷的种类进行结构鉴定。并且破坏了花青素苷天然存在的形式，无法全面有效地研究花青素苷的结构和功能。同时，水解法需要从专业的化学试剂公司购得标准品进行洗脱速度的比较才能推断花青素苷元的结构。TLC法和水解法准确性不高，操作复杂且所需分析成本也较高。