[发明专利]一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨基酸盐的制备方法，尤其是涉及一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法。

背景技术

L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐是广泛使用于医药保健的原料，是一种肌肉能量合剂，同时也能帮助加速生长激素缺乏的孩子生长和加速外伤患者的创伤愈合。

制备L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的方法主要是L-鸟氨酸与α酮戊二酸直接成盐反应后结晶。而由于L-鸟氨酸制备方法的不同，可以由不同途径来制备L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐。

目前，国内外对制备L-鸟氨酸的文献报道很多，L-鸟氨酸的制备方法主要有三种：化学法、发酵法、酶解法。

化学法：目前工业上最常用的生产方法是采用化学水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸，1966年shell int.Rearsch采用丙稀酸和氰化钠作为主要原料合成L-鸟氨酸。(GB1020492，1966)。

发酵法：用肠杆菌中的某些菌类如Escherichia coli，Aerobacter aerogenes，Proteusrettgeri和Proteus mirabili的突变菌株，进行发酵生产L-鸟氨酸，发酵液中L-鸟氨酸最高为15mg/ml，(GB1098348，1968；US39668072，1972)，Shibuya等利用Arthrobacter citreus23-2A的突变株发酵生产L-鸟氨酸，发酵72h，产率为35.2g/L。

酶解法：沈淑英等用粪链球菌ATCC8043，粪产碱杆菌ATCC21400，粪链球菌S-43游离细胞转化底物L-精氨酸制备L-鸟氨酸，转化率95-100％，提取收率为85-90％(天津微生物，1981，3：28-38)。1995年，M Kyriakos等利用从动物肝脏中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于L-鸟氨酸盐的制备(US5405761，1995)。

因为上述L-鸟氨酸酶法生产过程都是利用游离细胞转化底物L-精氨酸，所以转化液中会含有少量菌体蛋白和其他杂质，不利于产物的分离纯化；且转化要去除菌体，降低产物得率，导致生产成本增加。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、精氨酸转化率高、产量高的固定化酶生产L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)固定化酶的制备

取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂，用碳酸钾溶液浸泡6-18h后过滤，再将滤出的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化氢按重量比为1∶(0.1-0.6)∶(0.2-0.5)配制成溶液，于冰浴中反应5-60min，调节pH值至7-10，再加入精氨酸酶，使其与三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量比为(0.002-0.01)∶1，于1-10℃反应12-48h，洗涤后用饱和食盐水浸泡0.5-3h，再利用去离子水洗净至溶液中检测不出氯离子，即得固定化酶，保存于水中；

(2)转化条件的优化

将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按重量比1∶(1-3)∶(0.004-0.02)混合，加入去离子水中，搅拌，采用乙酸调节pH值至9.0-9.4，在35-40℃下，反应15-18h得固定化酶混悬液；

(3)产物提取及精制

将步骤(2)中的固定化酶混悬液过滤后，向滤液中加α酮戊二酸、活性炭，于20℃以下搅拌反应5-30min后，过滤，加入醇类，搅拌0.5-1h，析出L-鸟氨酸-α-酮戊二酸盐，搅拌3-5h，控温至20℃以下、离心、干燥即得产品。

所述步骤(1)中的溶液中含三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的重量百分浓度为40-60g/ml。

所述步骤(1)中的碳酸钾为摩尔浓度1-5M的溶液，所述的溴化氢为重量百分浓度1-4g/ml的溶液，所述的精氨酸酶为重量百分浓度1-4g/L的溶液。

所述步骤(1)中调节pH采用摩尔浓度为0.05-2M的碳酸氢钠溶液。

所述步骤(1)中洗涤过程是依次利用体积为100-400ml，浓度为0.05-0.3M的碳酸氢钠溶液、0.5-4M的氯化钠溶液及去离子水洗涤2-5次。

所述步骤(2)中搅拌反应的搅拌速度为70-80rpm，反应终点利用高效液相(HPLC)控制。

所述步骤(3)中加入α酮戊二酸量为：[(精氨酸量×0.96)×133/174]-(调pH所用的乙酸量)，活性炭的加入量为2-5g/100ml滤液。