[发明专利]一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，具体为一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法。

背景技术

我国的猪种资源丰富，分为地方品种、培育品种及外来品种三大类，不同的猪种之间具有很大的差异。北京黑猪是我国较为成熟的培育品种之一，具有体型较大、生长速度较快等优点，但其与外来品种在肉品质上的差异研究较为稀少。肉品质是一个综合的、相对模糊的复杂概念，因此在不同国家、不同地区都具有不同的评价体系与标准。国内通常选用的评价指标与测量方法对引进猪品种及中国地方猪品种的常规肉品质性状进行了测定，并进行对测定结果进行了比较分析，为研究影响猪肉品质候选基因提供研究基础。

与此同时，越来越多的研究表明，肌纤维作为肌肉基本组成单位，其自身理化性质在很大程度上可能影响肉品质性状。有关肌纤维性质的研究早在上世纪70年代就已经开始，但目前的研究主要集中于肌纤维性质的生物学特点以及简单的肌纤维类型分布状况的探索。传统的研究肌纤维性质的方法主要为免疫组织化学方法，不同的染色方法得到的结论不尽相同无法准确定义肌纤维类型。传统的研究肌纤维性质的方法多为组织化学染色方法，不同染色方法得出的结论不尽相同，无法准确定义肌纤维类型。近年，随着功能基因组学的发展，对肌球蛋白重链研究的逐渐深入，一种更为准确的分子分型方法被引入到肌纤维类型组成的研究中。在哺乳动物的骨骼肌和心肌上总共发现了8种肌球蛋白异构体，分别由不同基因编码。Schiaffino(Schiaffino and Reggiani，1994，Schiaffino and Reggiani，1996)和Weiss(Weiss and Leinwand，1996)等在对啮齿类和人类的研究中，确认了与肌纤维类型相对应的四种肌球蛋白重链亚型。Chang和Femandes等人研究发现在猪的骨骼肌上表达的MyHC有四种类型，I、II a、II b和II x，分别由不同的基因编码，并依据肌纤维特有的MyHC类型将猪的肌纤维分为四种类型，从基因表达水平对猪骨骼肌中各种类型肌纤维的组成情况进行研究，发现四种MyHC亚型表达比例不同的肌肉表现出不同的收缩能力和ATP酶活性(Chang，et al.，2003，Klont，et al.，1998)。因此，根据不同类型骨骼肌纤维肌球蛋白重链基因上游序列差异，设计特异引物，对肌肉组织中不同类型肌球蛋白重链基因mRNA表达量进行测定，进而分析肌肉中不同类型肌纤维的组成比例。这种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的分子分型比组织化学评定更为准确、可靠。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的，比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子分型方法。

为了达到上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物与探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异设计合成的TaqMan探针。

进一步，猪MyHC I基因引物序列(5’-3’)为“GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT”，其TaqMan探针为“TTGCGCTCCACACATC”，其参考序列GenBank登录号为“U75316”。

进一步，猪MyHC II a基因引物序列(5’-3’)为“CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT”，其TaqMan探针为“CCGTGTCTGCCCTTTT”，其参考序列GenBank登录号为“AB025260”。

进一步，猪MyHC II b基因引物序列(5’-3’)为“ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025261”。

进一步，猪MyHC II x基因引物序列(5’-3’)为“CTTCACTGCGCAGCAGGGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025262”。

进一步，检测中所用内参基因，猪GAPDH基因，参考序列GenBank登录号为“AF069649.1”。