[发明专利]一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法

权利要求书

1.一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物和探针是根据猪MyHC I、MyHC II a、MyHC II b和/或MyHC II x基因cDNA上游序列差异设计的，所述探针为TaqMan探针，所述的猪MyHC I基因参考序列GenBank登录号为“U75316”，其基因引物序列为5’-GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT-3’，其TaqMan探针为5’-TTGCGCTCCACACATC-3’，所述的猪MyHCII a基因参考序列GenBank登录号为“AB025260”，其基因引物序列为5’-CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT-3’，其TaqMan探针为5’-CCGTGTCTGCCCTTTT-3’，所述的猪MyHC II b基因参考序列GenBank登录号为“AB025261”，其基因引物序列为5’-ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT-3’，其TaqMan探针为5’-ATGAGACCAAAACTCC-3’，所述的猪MyHC II x基因参考序列GenBank登录号为“AB025262”，其基因引物序列为5’-CTTCACTGCGCAGCAGG GGACGAGTTCGTGCTCCAT-3’，其TaqMan探针为5’-ATGAGACCAAAACTCC-3’。

2.根据权利要求1所述的mRNA定量检测方法，进一步地包括了内参基因的使用，所述的内参基因为猪GAPDH基因，其参考序列GenBank登录号为“AF069649.1”。

3.根据权利要求1或2所述的一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其特征在于：，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤：

1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL，使用前加入β-巯基乙醇，用研磨杵将组织彻底研磨，或使用匀浆器将组织匀浆；之后向研磨或匀浆过的组织中加入590μl RNase-free ddH₂O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟；

2)12,000rpm离心2-5分钟，提取上清；

3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，吸附柱放在收集管中，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀；

6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I工作液，室温放置15分钟；

7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

8)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

9)重复步骤8)；

10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液；

12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为18SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。