[发明专利]一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种穿梭质粒，特别是一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法。

背景技术：

生物工程领域中，为了有效表达克隆基因，常常需要进行表达载体的构建。大肠杆菌表达系统是基因工程研究中最常用的一种。它虽然不能如真核系统那样进行翻译后加工，但大肠杆菌其遗传背景相对清楚，操作简便、生长周期短、经济安全，因此仍然是使用最广泛、也是不可被替代的系统，在基因工程基础研究和实际应用中成为不可缺少的重要工具。一些重要的外源基因在大肠杆菌中获得了占菌体总蛋白30％甚至40％多的高效表达量。通常大肠杆菌表达载体应满足以下要求：1、适用范围要广；2、基因表达量高；3、表达的产物容易纯化；4、质粒稳定性要好。可是迄今为止还没有一个表达载体能完全满足上述要求。就表达基因的质粒载体来说，一般最好要符合下面的条件：1、表达载体要具有多拷贝或高拷贝性；2、最好具有可诱导的强启动子；3、有强的转录终止序列；4、有最佳最有效的翻译起始序列。而要是具有分泌表达则更具优越性，这样表达蛋白可正确折叠，更具生物活性且产物可溶；而且表达的蛋白分泌到胞外，能方便分离纯化。在这些系统中，枯草杆菌就具有这种功能，枯草杆菌还是一种非致病性微生物，对人畜无害，所以常被许多研究者作为表达系统加以应用。但是在实际应用过程中，枯草杆菌质粒的提取与转化效率明显不如常用的大肠杆菌。如果在大肠杆菌中进行DNA分子操作，显得简便易行，完成了基因操作后，再在枯草杆菌中进行外源蛋白的高效表达，表达产物分泌于胞外，可以较好的解决和克服大肠杆菌表达产生包涵体，需要变性复性的烦琐操作。所以构建大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达分泌载体成为一个重要选择[工业微生物，1989，19(1)：1-6；生物工程学报，2002，18(4)：438-4411；遗传学报，2000，27(7)：647-6531]。上个世纪后期，许多科学工作者构建各类表达载体，以期能够在大肠杆菌、或者在枯草杆菌、或者在大肠杆菌-枯草杆菌等不同的载体中同时高效表达基因。有的构建多功能启动子同时启动表达以提高表达水平等等。所有的研究目的只有一个，那就是千方百计以最小成本换取最大表达产量，以降低表达产物如生物医药产品的生产成本；或者大大减少研究开发的时间和成本。所以，公开发表有许多不同表达载体构建成功的报导，以满足不同研究和生产目的的需要。这些表达载体进行融合表达、有的非融合表达、有的进行分泌型表达、有的带纯化标签的表达等等。

本发明构建的表达载体符合上述条件。本发明以杀菌肽牛乳铁蛋白、人源LL-37、溶菌酶等这些对宿主产生毒杀作用的蛋白作为报告基因进行操作，更有优越性。能够克服其对宿主的毒杀作用，进行在原核生物中表达重要目的蛋白更具有实际意义。