[发明专利]一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒及其构建方法无效
| 申请号： | 201010255590.4 | 申请日： | 2010-08-17 |
| 公开（公告）号： | CN101948865A | 公开（公告）日： | 2011-01-19 |
| 发明（设计）人： | 乐科易;张培德 | 申请（专利权）人： | 复旦大学 |
| 主分类号： | C12N15/75 | 分类号： | C12N15/75;C12N15/66;A61K48/00;A61P31/04;A61P31/10 |
| 代理公司： | 上海世贸专利代理有限责任公司 31128 | 代理人： | 严新德 |
| 地址： | 200433 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 启动子 诱导 分泌 穿梭 质粒 及其 构建 方法 | ||
1.一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：由一个PstI酶切的大肠杆菌pET-28a质粒和一个PstI酶切的枯草杆菌pE194质粒构成，所述的酶切的大肠杆菌pET-28a质粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段由溶菌酶和抗菌肽基因融合而成。
2.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因的两端设置有NdeI和XhoI酶切位点。
3.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段的两端设置有KpnI和NheI酶切位点。
4.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因为一种、或者任意两种、或者两种以上的杀菌功能肽氨基酸片段的组合，或者任意一个功能片段的重复串联融合。
5.如权利要求4所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：所述的抗菌肽基因为牛乳铁蛋白肽基因、或者人源杀菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、或者天蚕素基因、或者蛙皮素基因、或者蜂毒素基因、或者人源抗菌肽LL-37基因。
6.如权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒，其特征在于：所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切识别位点氨基酸序列为GGG。
7.权利要求1所述的一种双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒的构建方法，其特征在于：包括一个在NdeI和XhoI位点酶切大肠杆菌pET-28a质粒的步骤，在所述的酶切大肠杆菌pET-28a质粒NdeI和XhoI酶切位点之间插入至少一个抗菌肽功能片段，还包括一个构建启动子信号肽片段的步骤，在所述的启动子信号肽片段上依次设置有BglII、PstI、NheI、KpnI和BglII酶切位点，所述的启动子信号肽片段的序列如SEQID NO：2所示，然后分别用BglII酶切启动子信号肽片段和大肠杆菌pET-28a质粒，采用连接酶连接，形成一个插入有启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒，还包括一个构建溶菌酶-抗菌肽功能片段的步骤，在溶菌酶-抗菌肽功能片段的两端分别设置有NheI和KpnI酶切位点，然后在插入有启动子信号肽片段的大肠杆菌pET-28a质粒的NheI和KpnI位点酶切，插入溶菌酶-抗菌肽功能片段，采用连接酶连接，形成一个插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a质粒，还包括一个在插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a质粒的PstI位点酶切的步骤，在PstI位点酶切的枯草杆菌pE194质粒，然后插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段的大肠杆菌pET-28a质粒，构成本发明的双启动子可诱导可分泌型穿梭质粒。
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